侯衛(wèi)坤，王 博，劉 林，許 鵬*

(1西安交通大學醫(yī)學部附屬紅會醫(yī)院關節(jié)病醫(yī)院骨壞死與關節(jié)重建病區(qū)，西安 710054；2西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心；*通訊作者，E-mail：sousou369@163.com)

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IL-22促進滑膜細胞表達MMP3、VEGF而抑制MMP13的表達

侯衛(wèi)坤1，王 博2，劉 林1，許 鵬1*

(1西安交通大學醫(yī)學部附屬紅會醫(yī)院關節(jié)病醫(yī)院骨壞死與關節(jié)重建病區(qū)，西安 710054；2西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心；*通訊作者，E-mail：sousou369@163.com)

目的 觀察IL-22在體外對滑膜成纖維細胞MMP3、MMP13及VEGF表達的影響。 方法 納入2012-03～2012-06在西安市紅會醫(yī)院接受全膝關節(jié)置換術的患者，分為類風濕性關節(jié)炎(RA)及骨性關節(jié)炎(OA)兩組，每組各8例患者；用實時定量PCR檢測膝關節(jié)滑膜組織IL-17、IL-22、IL-17RA、IL-22R1、IL-22BP、AHR、MMP3及MMP13等基因mRNA水平的表達。體外培養(yǎng)滑膜細胞系HTB-93，分為對照組、IL-22組及IL-22+IL-22BP組，實時定量PCR檢測MMP3、MMP13及VEGF基因mRNA水平的表達變化。結果采用Mann-WhitneyU檢驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)。 結果 在OA滑膜組織中，IL-22、IL-22R1、AHR以及MMP13 mRNA表達水平較在RA滑膜組織中高(P<0.05)，而IL-17RA及MMP3則相反，在RA滑膜組織中表達較高(P<0.05)。體外培養(yǎng)HTB-93滑膜細胞系上，與對照組相比，IL-22組MMP3和VEGF的mRNA表達上調(P<0.05)，而MMP13的mRNA表達下調(P<0.05)；與IL-22組相比，IL-22+IL-22BP組的MMP3和VEGF的mRNA表達有下調趨勢，而MMP13的mRNA表達有上調趨勢，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論 IL-22在OA滑膜組織中的表達較高，在體外可促進滑膜細胞表達MMP3、VEGF而抑制MMP13的表達。

骨性關節(jié)炎； 類風濕性關節(jié)炎； IL-22； 滑膜細胞； MMP； VEGF

IL-22是Th22型細胞分泌的代表性細胞因子，其通過與特異性的IL-22R1結合發(fā)揮作用，在機體內存在IL-22的可溶性受體IL-22BP，對IL-22的信號轉導起抑制作用。IL-22在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮作用，本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)IL-22在關節(jié)炎的慢性期表達顯著增高(未發(fā)表)，然而，其在滑膜炎發(fā)病中的作用尚不明確。

類風濕性關節(jié)炎(RA)和骨性關節(jié)炎(OA)是兩種不同類型的關節(jié)炎，均可表現(xiàn)出滑膜炎。RA為一種慢性免疫炎性疾病，滑膜炎是其主要病理改變，活化的T細胞在RA發(fā)病過程中起著重要作用[1,2]。OA的特征性病理改變是關節(jié)軟骨的進行性退變和繼發(fā)性骨質增生[3]，關節(jié)滑膜也可出現(xiàn)一定的增生和淋巴細胞浸潤，是導致中老年人殘疾的主要疾病之一[4,5]。

為進一步明確IL-22對滑膜炎的作用，本研究比較兩種疾病滑膜組織中IL-22相關基因表達譜的改變，進一步在體外觀察IL-22對滑膜細胞的功能影響。

1 材料與方法

1.1 RA和OA患者滑膜標本收集

本實驗研究對象RA和OA患者各8例，為2012-03～2012-06西安市紅會醫(yī)院住院接受全膝關節(jié)置換術的患者。根據(jù)病史、查體和X線片等資料，參照美國風濕病學會(1986)推薦的膝關節(jié)RA和OA診斷標準進行診斷[6]。排除標準為合并嚴重心肺功能不良、肺炎、泌尿系感染，術前服用激素、免疫抑制劑等。在進行膝關節(jié)置換手術時，切下的滑膜先除凈附著的脂肪組織后轉移到-80 ℃低溫冰箱凍存。所有研究對象填寫了書面知情同意書。本研究經(jīng)西安市紅會醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 細胞株、主要試劑和儀器

HTB-93(滑膜細胞株)購自美國ATCC細胞庫，IL-22(美國Peprotech公司)，IL-22BP(美國R&D Sytems公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)，SYBR green熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，PCR引物合成(上海生工)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(杭州四季青)，微量核酸/蛋白定量儀(Cecil儀器公司，型號CE 2301)，實時定量PCR儀(iQ5，美國Bio-Rad公司)，全波長酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3 研究方法

將患者滑膜組織中的RNA提取，采用實時定量PCR檢測IL-17、IL-22、IL-17RA、IL-22R1、IL-22BP、AHR、MMP3及MMP13等基因mRNA的表達；進行HTB-93細胞培養(yǎng)，觀察IL-22對滑膜細胞增殖的影響，再用實時定量PCR檢測MMP3、MMP13及VEGF等基因mRNA的表達。

1.4 RNA提取、定量和鑒定、逆轉錄cDNA及實時定量PCR

滑膜組織及細胞的總RNA采用Trizol的方法提取。將得到總RNA在微量核酸/蛋白定量儀上定量，測OD260/OD280比值在1.8-2.0之間?？俁NA采過瓊脂糖凝膠電泳的方法進行鑒定，觀察28S、18S條帶清晰完整，兩個條帶灰度的比值是否接近2 ∶1，提取RNA的質量良好。按照生廠商(加拿大Fermentas公司)的說明書，mRNA首先逆轉錄合成cDNA第一鏈。先用純水將cDNA稀釋8倍；在200 μl的PCR 8連管中加入4 μl cDNA模板、5 μl 2×SYBR Green Ⅱ Supermix以及上下游引物各0.5 μl；混勻、離心；在實時定量PCR儀上檢測IL-17、IL-22、IL-22R1、IL-22BP、AHR、MMP3、MMP13及VEGF等基因mRNA水平的表達。反應條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，退火溫度20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。所用引物和退火溫度見表1，內參照選用β-actin，基因表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.5 細胞培養(yǎng)及實驗分組

體外培養(yǎng)HTB-93細胞，培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在6孔板中接種細胞的數(shù)量為每孔30×104個細胞；接種后24 h進行干預實驗。實驗分組為：對照組(每孔加入2 ml PBS)，IL-22組(每孔加入2 ml含10 ng/ml IL-22的培養(yǎng)基)，IL-22+IL-22BP組(每孔加入2 ml含10 ng/ml IL-22及10 ng/ml IL-22BP的培養(yǎng)基)，每組均有3個復孔；培養(yǎng)48 h收獲細胞。

表1 實時定量PCR引物信息

Table 1 Sequences of real time PCR primers

引物序列(5'-3')擴增長度(bp)退火溫度(℃)hIL-17Sense:GACTCCTGGGAAGACCTCATTGGAntisense:CTTGTCCTCAGAATTTGGGCATCC11554hIL-22Sense:CCTATATCACCAACCGCACCTTCAntisense:AGATTGAGGGAACAGCACTTCTTC17653hIL-17RASense:GTGAGCACGCCAGGATGAAGAntisense:TTGGATCGCTGGTGGAACTC23158hIL-22R1Sense:TCCAGCCTCACCACTCACAAGAntisense:TTCATTTCATCTTCACCACAACTCC13061hIL-22BPSense:CAGTGGGTAGCAGGAGAAGGACAntisense:GGAGAGGCAGTGAGCAGGAG19753hAHRSense:CTAACAGATGAGGAAGGAACAGAGCAntisense:AGAGTGGATGTGGTAGCAGAGTC18264hMMP3Sense:AACAATGGACAAAGGATACAACAGGAntisense:CATCTTGAGACAGGCGGAACC16264hMMP13Sense:CAGTGGTGGTGATGAAGATGATTTGAntisense:TCTAAGGTGTTATCGTCAAGTTTGC19764hVEGFSense:CTACCTCCACCATGCCAAGTAntisense:TCTCTCCTATGTGCTGGCCT31158hβ-actinSense:ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG17961

1.6 細胞增殖檢測

MTT法通過讀取OD490值而反映細胞活力，而細胞活力與細胞數(shù)呈正相關，本研究通過MTT法檢測IL-22對滑膜細胞增殖的影響，按照加入IL-22的不同濃度進行分組。96孔板中每孔接種2×104個MTB-93細胞；接種第2天細胞完全貼壁后，每孔加入含不同濃度IL-22(5，10，20，40 ng/ml)的培養(yǎng)基200 μl，每個濃度都有6個復孔；24 h或48 h再加入MTT 20 μl(5 mg/ml)，繼續(xù)在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h；小心棄去培養(yǎng)基，再加入150 μl DMSO，在微量振蕩器上充分振蕩10 min，使結晶物完全溶解；在全波長酶標儀上讀取OD490值。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)分布不符合正態(tài)分布，采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗統(tǒng)計；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RA與OA滑膜組織中細胞因子mRNA的表達

在OA滑膜組織中，IL-22、AHR以及MMP13 mRNA表達水平較在RA滑膜組織中高(P<0.05)，而IL-17RA及MMP3則相反，在RA滑膜組織中表達較高(P<0.05)。IL-22R1在OA滑膜組織的表達水平較在RA滑膜組織中的表達水平有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而IL-22BP相反，在RA滑膜組織中的表達水平有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，二者的比值IL-22R1/IL-22BP在OA中顯著高于RA滑膜組織中(P<0.05)。IL-17在兩組之間的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05,見圖1)。

2.2 IL-22對滑膜細胞表達MMP3、MMP13及VEGF的影響

體外培養(yǎng)滑膜細胞系HTB-93，觀察不同濃度IL-22分別刺激24 h 或48 h對細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)5,10,20,40 ng/ml濃度都對HTB-93細胞的增殖無明顯影響(P>0.05，見圖2A,2B)。在滑膜細胞系HTB-93上，與對照組相比，IL-22組MMP3和VEGF的mRNA表達上調(P<0.05)，而MMP13的mRNA表達下調(P<0.05)；同IL-22組相比，IL-22+IL-22BP組的MMP3和VEGF的mRNA表達有下調趨勢，而MMP13的mRNA表達有上調趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖2C-E)。

與OA比較,*P<0.05圖1 OA與RA患者膝關節(jié)滑膜組織中相關基因的mRNA表達Figure 1 Comparison of related gene mRNA expression in synovial tissues between OA and RA patients

A，B.MTT法檢測不同濃度IL-22對HTB-93細胞增殖的影響，分別觀察了作用24 h(A)和48 h(B)兩個時間點；C-E.10 ng/ml IL-22單獨刺激或者10 ng/ml IL-22+10 ng/ml IL-22BP聯(lián)合作用于HTB-93細胞系48 h后MMP3(C)、MMP13(D)以及VEGF(E)mRNA的表達改變;與對照組(Ctrl)比較，*P<0.05圖2 IL-22對滑膜增殖及表達MMP3、MMP13和VEGF的影響Figure 2 Effect of IL-22 on synovial proliferation and expression of MMP3,MMP13 and VEGF

3 討論

IL-22與RA發(fā)病關系尚不明確。在RA患者血漿中IL-22表達水平較正常高，的滑膜組織中IL-22及IL-22R1的mRNA均顯著上調，而IL-22陽性細胞既有A型滑膜細胞，也有B型滑膜細胞；IL-22R1主要表達在B型滑膜細胞上[7]。在CIA小鼠模型上，也發(fā)現(xiàn)血清中IL-22的表達較正常對照組顯著升高，而IL-22-/-小鼠CIA的發(fā)病率及發(fā)病程度均顯著下降，其滑膜組織中的促炎因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)和MMP9的mRNA表達也下降[8]。

MMP是一大類降解細胞外基質的蛋白酶，它們在組織降解、修復等過程中起著重要作用。MMP3又叫間質溶解素1，可降解纖連蛋白、層粘連蛋白、Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ、Ⅹ型膠原以及軟骨蛋白聚糖；MMP13也稱為膠原酶Ⅲ，可特異性的降解CⅡ、也可降解Ⅰ和Ⅲ型膠原，在關節(jié)軟骨轉換和OA的病理改變中其重要作用。MMP3與局部細胞的遷移有關，而MMP13可能與軟骨內成骨過程相關[9]。

在皮膚損傷修復的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-22可刺激角質形成細胞分泌MMP3，并且使角質形成細胞的遷移性增加，從而加速組織愈合[10，11]。本研究結果顯示IL-22可促進滑膜細胞表達MMP3，與皮膚組織中的研究結果一致，提示IL-22可能在關節(jié)滑膜組織的修復過程中起作用。然而，本研究的結果發(fā)現(xiàn)IL-22抑制MMP13的表達?？赡艿脑蛉缦拢菏紫龋琈MP3和MMP13的調節(jié)方式不盡相同。MMP3和MMP13的啟動子區(qū)均有AP-1的結合位點，因此，IL-1和TNF-α通過激活MAPK通路調節(jié)AP-1的表達，進而促進MMP3和MMP13的表達；激活MMP3的另一途徑是NF-κB，在MMP3的啟動子區(qū)有它的結合區(qū)域，而MMP13的啟動子區(qū)則無[12]。已有資料表明，STAT通路也參與MMPs基因的表達，在皮膚損傷修復以及腫瘤侵襲和轉移中起著調節(jié)作用[13,14]。由于IL-22主要激活JAK-STAT，因此，IL-22對MMP3和MMP13的調節(jié)作用不同可能是由此造成的。然而在RA和OA患者滑膜中的檢測結果為IL-22與MMP13的表達呈正相關，而與MMP3負相關。提示，體內除了IL-22以外，還有其他因素參與了MMPs的調節(jié)。其次，在正常關節(jié)組織，MMP3主要表達于滑膜細胞，而MMP13主要在軟骨細胞高表達。因此，IL-22對MMP13的作用還需要進一步在軟骨細胞上核實。IL-22可能通過調節(jié)滑膜細胞分泌MMP3而降解基質。

在RA發(fā)病過程中，血管翳的生成是引起關節(jié)軟骨和軟骨下骨破壞、關節(jié)粘連及后期的關節(jié)強直的最關鍵因素。由于血管翳可釋放出一些水解酶和細胞因子，加劇膠原基質的降解，最終逐步侵蝕關節(jié)軟骨和軟骨下骨，導致關節(jié)重塑。而VEGF是在血管生成過程中其重要作用的因子。本研究的結果發(fā)現(xiàn)正常滑膜細胞不表達VEGF，而IL-22可刺激滑膜細胞產(chǎn)生VEGF，并且其作用可被IL-22BP抑制。該結果提示，IL-22可能也參與了血管生成的調節(jié)過程。

總之，IL-22使關節(jié)滑膜細胞分泌MMPs，從而促進關節(jié)軟骨及細胞外基質的降解；也可促使滑膜細胞表達VEGF，參與血管生成的調節(jié)。

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IL-22 promotes MMP3 and VEGF and suppresses the expression of MMP13 in synovial cells

HOU Weikun1,WANG Bo2，LIU Lin1，XU Peng1*

(1OsteonecrosisandJointReconstructionWard，DepartmentofJointSurgery，HonghuiHospital，Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter，Xi’an710054，China；2CenterforTranslationalMedicine，F(xiàn)irstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor，E-mail:sousou369@163.com)

ObjectiveTo explore the influence of IL-22 on expression of MMP3，MMP13 and VEGF gene in synovial cellsinvitro.MethodsFrom March 2012 to June 2012，16 patients undergoing total knee arthroplasty in Xi’an Honghui Hospital，8 patients with OA and 8 patients with RA，were recruited.Real-time quantitative PCR was used to detect mRNA expression levels of IL-17，IL-22，IL-17RA，IL-22R1，IL-22BP，AHR，MMP3 and MMP13 in synovial tissues.The synovitial cell line HTB-93 wereinvitrocultured，and divided into control group，IL-22 group and IL-22+IL-22BP group.Then mRNA expression levels of MMP3，MMP13 and VEGF were detected by real-time quantitative PCR.Mann-WhitneyUtest was used to analyze the data.ResultsThe mRNA expression levels of IL-22，IL-22R1，AHR and MMP13 were higher in synovial tissues of OA patients than those of RA(P<0.05)，while the expression of IL-17RA and MMP3 was lower(P<0.05).Invitro，the mRNA expression levels of MMP3 and VEGF were higher in IL-22 group than in control group(P<0.05)，while the expression of MMP13 was lower(P<0.05).Compared with IL-22 group，the mRNA expression levels of MMP3 and VEGF decreased while the expression of MMP13 increased in IL-22+IL-22BP group,but there was no statistical significance(P>0.05).ConclusionThe mRNA expression of IL-22 is higher in synovial tissues of OA patients than that of RA patients.IL-22 may promote the expression of MMP3 and VEGF，and suppress the expression of MMP13 in synovial cells in vitro.

osteoarthritis; rheumatoid arthritis; IL-22; synovial cells; MMP; VEGF

國家自然科學青年基金資助項目(81201373)；陜西省博士后科研基金資助項目(2016BSHEDZZ93)

侯衛(wèi)坤，男，1983-07生，博士，主治醫(yī)師，E-mail：weikunhou@163.com

2016-06-03

R684.3

A

1007-6611(2017)04-0343-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.009