趙利軍,李開濟,吳 靜,門秀麗*

(1華北理工大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，唐山 063000;2唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室;*通訊作者,E-mail:xiulimen@126.com)

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缺血后處理對止血帶休克致腎損傷的作用

趙利軍1,2,李開濟1,2,吳 靜1,2,門秀麗1,2*

(1華北理工大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，唐山 063000;2唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室;*通訊作者,E-mail:xiulimen@126.com)

目的 觀察缺血后處理對止血帶休克致腎損傷的作用,并探討其可能機制。 方法 30只SD大鼠隨機分為對照組(Control組)、止血帶休克組(TOS組)和缺血后處理組(I-postC組)。止血帶法制作止血帶休克動物模型,另對I-postC組動物在止血帶休克基礎上實施缺血后處理。經腹主動脈取血測各組大鼠血漿肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、C反應蛋白(CRP)水平;腎組織勻漿測組織SOD、MDA、XOD和MPO水平;免疫組化法檢測腎組織細胞凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax的表達;TUNEL法檢測腎細胞凋亡;電鏡下觀察腎組織超微結構改變。 結果 ①與Control組比較,后兩組腎組織SOD活力明顯降低(P<0.01),血漿Cr、BUN、CRP均升高(P<0.01);腎組織MDA、XOD和MPO升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);免疫組化檢測中Bax蛋白表達增強而Bcl-2蛋白表達略增強;TUNEL法檢測可見腎細胞凋亡數目增多;透射電鏡下可見腎近曲小管上皮細胞核固縮,胞內空泡,溶酶體和致密顆粒沉積增多,部分線粒體嵴斷裂或模糊。腎小球足突細胞突起不規(guī)則、融合,線粒體嵴斷裂并減少,有空泡,粗面內質網擴張。②與TOS組比較,I-postC組腎組織SOD活性增強,血漿Cr、BUN、CRP及腎組織MDA、XOD、MPO等相關損傷指標均有所下降,差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)；Bcl-2蛋白表達增強而Bax減弱,腎凋亡細胞數目減少。電鏡下觀察可見腎小管上皮細胞及腎小球毛細血管內皮細胞損傷程度減輕。 結論 肢體長時間應用止血帶可導致腎功能障礙和腎組織結構損傷,缺血后處理可通過減少氧自由基生成和抑制炎癥反應,減輕腎損傷。

止血帶休克； 腎損傷； 缺血后處理； 細胞凋亡

肢體在遭受一定時間重度缺血后再突然恢復血供,有時會發(fā)生更為嚴重的組織損傷,機體甚至陷入休克狀態(tài),臨床上稱之為止血帶休克(tourniquet shock，TOS),這也是臨床外科多器官功能障礙發(fā)生的常見病因。大量資料表明,腎臟是止血帶休克過程中最易受累的器官之一,嚴重時表現為急性腎功能衰竭(acute renal failure,ARF)[1]。缺血后處理(ischemic postconditioning，I-postC)是一種在組織長時間缺血后多次短暫的缺血和恢復血供交替進行的預處理方法[2],對止血帶休克中腎臟功能和結構的影響尚不完全明確。本研究應用I-postC措施,從多方面觀察止血帶休克時腎臟的變化,探討I-postC的器官保護意義及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級健康雄性SD大鼠30只,清潔級,體重200-250 g,購自河北聯合大學實驗動物中心。動物合格證號:SCXK京2009-0004。將大鼠隨機分為3組(每組10只):對照組(Control組)、止血帶休克組(TOS組)和缺血后處理組(I-postC組)。

1.2 動物模型

制作大鼠止血帶休克模型[3],即:在乙醚淺麻醉下,用標準化彈性的橡皮帶結扎大鼠雙后肢根部使其缺血4 h,然后松解橡皮帶恢復血供4 h。I-postC組在缺血4 h后,行缺血5 min和恢復血液灌注5 min,重復3次的操作,即缺血后處理,然后再持續(xù)恢復血流灌注4 h。Control組的橡皮帶僅松弛環(huán)繞雙后肢不阻斷血流。

1.3 標本檢測

①全麻下開腹經腹主動脈取血,離心15 min(3 500 r/min),應用全自動生化分析儀測定血漿肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)含量。②摘取一側腎臟并迅速縱向剖開,冷生理鹽水沖洗,用濾紙吸附表面水分,扭力天平稱取腎組織200 mg制作組織勻漿,離心取上清液,用分光光度法測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的變化趨勢。③橫向切取對側腎組織塊約4 mm長,立即投入10%甲醛溶液中固定,石蠟包埋,低溫切片,TUNEL法檢測細胞凋亡;免疫組化法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax的表達情況。④術中在腎皮質部位迅即切取米粒大小腎組織,投入冷4%戊二醛-磷酸緩沖液,再修成1 mm×1 mm×1 mm的小塊預固定,轉入2.5%戊二醛中固定,經丙酮脫水、環(huán)氧樹脂包埋,制作超薄切片,染色后在透射電鏡下觀察腎組織超微結構。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 實驗結果

2.1 血漿Cr、BUN和CRP測定結果

與Control組比較,TOS組和I-postC組的Cr、BUN和CRP均明顯升高(P<0.01);I-postC組與TOS組比較,三者含量均降低(P<0.01，見表1)。

2.2 腎組織SOD、XOD、MDA、MPO測定結果

與Control組比較,TOS組MDA、XOD和MPO均明顯升高(P<0.01);I-postC組與TOS組比較,MDA、XOD和MPO均降低(P<0.01,見表2),SOD均降低,損傷減輕。

組別Cr(U/L)BUN(U/L)CRP(U/L)Control組21.55±3.905.06±1.623.53±0.21TOS組58.93±6.76**17.09±2.06**6.05±0.80**I-postC組27.86±2.31**##12.04±1.41**##4.98±0.68**##

與對照組比較，**P<0.01;與TOS組比較，##P<0.01

組別SOD(U/gprot)XOD(U/g)MDA(nmol/mg)MPO(U/g) Control組87.64±6.4874.96±4.63 4.98±0.490.39±0.06 TOS組46.86±4.66**111.00±10.05**11.01±1.00**1.04±0.15** I-postC組61.01±7.06**#87.47±5.16*##6.94±0.51**##0.57±0.09*##

與Control組比較,*P<0.05,**P<0.01;與TOS組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.3 腎組織細胞凋亡情況

激光共聚焦顯微鏡下觀察,Control組腎組織凋亡細胞罕見。TOS組可見較多TUNEL陽性信號為黃綠色或黃色熒光,位于胞核,呈小圓形、環(huán)行或顆粒狀。凋亡細胞主要見于腎小管上皮細胞和腎小球毛細血管內皮細胞,間質細胞凋亡少見(見圖1)。I-postC組TUNEL陽性細胞較IR組明顯減少。

A.Control組 B.TOS組 C.I-postC組圖1 TUNEL染色激光共聚焦顯微鏡下觀察腎組織細胞凋亡情況 (×200)Figure 1 Apoptosis in renal tissues under laser confocal microscope by TUNEL staining (×200)

2.4 腎組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況

Bcl-2蛋白和Bax蛋白陽性表達主要存在于腎小管上皮細胞和腎小球毛細血管內皮細胞胞漿內,呈棕黃色顆粒。Control組可見少量腎細胞胞質呈淺棕黃色,即Bcl-2和Bax蛋白弱陽性表達。TOS組及I-postC組陽性表達的細胞數目更多,且著色加深。與TOS組比較,I-postC組Bcl-2蛋白表達增強,而Bax蛋白表達明顯減少(見圖2)。

2.5 腎組織超微結構改變

透射電鏡下觀察可見Control組腎組織細胞結構清晰完整。TOS組可見近曲小管上皮細胞核固縮,線粒體數量減少,部分線粒體嵴斷裂或模糊,甚至空泡化。腎小球足突細胞足突排列不規(guī)則,部分突起融合;線粒體腫脹,空泡變性較明顯,線粒體嵴斷裂并減少,粗面內質網擴張(見圖3)。在I-postC組,腎組織超微結構的損傷改變較之TOS組有一定程度改善(見圖3)。

A-C.Control組、TOS組、I-postC組Bcl-2表達;D-E.Control組、TOS組、I-postC組Bax表達圖2 各組大鼠腎組織Bcl-2和Bax蛋白表達情況 (×200)Figure 2 Expression of Bcl-2，Bax protein in renal tissues (×200)

a:足突融合；b:內質網擴張；c:線粒體嵴斷裂、空泡化A-C分別為Control 組、TOS 組、I-postC 組的腎小球組織

d:核固縮,有較多空泡;e:線粒體嵴斷裂、空泡化D-F分別為Control 組、TOS 組、I-postC 組的腎小管組織圖3 電鏡下各組大鼠腎組織形態(tài)學 (Bar=1 μm)Figure 3 Morphology of renal tissue of rats in different groups under electron microscope (Bar=1 μm)

3 討論

在臨床外科實踐中,止血帶休克可見于松解結扎時間過長的止血帶后,由于各種毒素刺激以及有效循環(huán)血量不足導致的以神經-體液因子失調與急性循環(huán)障礙為特征的危重狀態(tài),是創(chuàng)傷性休克的一種[1]。以全身循環(huán)衰竭為基礎,急性腎損傷是止血帶休克常見且后果嚴重的并發(fā)癥。關于止血帶休克的防治,目前有多種藥物和措施，其中缺血后處理具有可控性好、操作簡單,無毒副作用等特點，臨床應用前景值得期待。

本實驗中,動物雙后肢在缺血期以無氧代謝為主要產能方式,乳酸、腺苷等酸性代謝產物生成增多,大量炎細胞活化。在第二個階段,隨著血流大規(guī)模的重新灌注,各種炎性介質(inflammatory mediators)、酸性代謝產物以及氧自由基(oxygen free radicals，OFR)等有毒有害物質均勻循環(huán)周身,成為遠隔器官受損的直接因素[4],腎臟是敏感器官之一。此外,在止血帶休克的全程,機體均處于應激狀態(tài),交感-腎上腺髓質及腎素-血管緊張素系統(tǒng)強烈激活,腎血管收縮,加上血流重新分布的調控作用,腎臟血供明顯不足,也是加重腎損傷的重要的神經-體液因素[5]。

SOD是生物體內主要的抗氧化酶,短期內可因清除OFR被消耗而活性下降。本實驗中缺血后處理組的SOD活性得以保護,可能是因為反復短暫的血流灌注,形成了局部組織的良性應激效應,抑制了XOD的過多生成,ATP不至于短時大量分解,氧自由基的生成受到了抑制,SOD總活性得到了保護。全身性炎癥反應(systemic inflammatory response)也是止血帶休克時遠位器官受累的主要機制[5],組織MPO活性可反映中性粒細胞的激活、游走和在組織內聚集的程度。CRP是一種非特異性炎性標志物[6],可在炎癥或損傷的急性期敏感表達。實驗中MPO和CRP的變化,驗證了止血帶休克時炎性反應在全身的播散,缺血后處理可在一定程度上抑制炎性反應,從而減輕了腎損傷的程度。

肢體局部長時間應用止血帶,可經多途徑啟動全身的細胞凋亡通路[7]。Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的重要基因,二者相互作用決定了細胞死亡的閾值[8]。本實驗中,血流再灌注后Bcl-2高度表達于腎小管上皮細胞,其抗細胞凋亡的主要機制在于抗氧化,抑制線粒體釋放細胞色素氧化酶(Cyto-C)、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)等促凋亡蛋白[9],抑制半胱天冬酶(caspase)激活,抑制Bax、Bak等細胞毒作用,維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)[10]。免疫組化結果提示,I-postC可增加Bcl-2表達而抑制Bax表達,上調Bcl-2/Bax 比值,減少細胞凋亡。在激光共聚焦顯微鏡下觀察腎組織細胞的凋亡,I-postC組陽性信號較TOS組明顯減少。血Cr和BUN是反映腎功能的常用指標,實驗結果提示I-postC可以降低血Cr和BUN水平,減輕止血帶休克腎損傷的程度。

綜上所述,缺血后處理可保護大鼠止血帶休克的腎臟,其機制可能與減輕氧化應激反應,抑制炎癥反應和抗細胞凋亡有關,有關更為詳盡的具體機制有待于進一步研究。

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Effect of ischemic postconditioning on kidney injury caused by tourniquet shock

ZHAO Lijun1,2,LI Kaiji1,2,WU Jing1,2,MEN Xiuli1,2*

(1DepartmentofPathophysiology，BasicMedicalCollege，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，Tangshan063000,China;2TangshanKeyLaboratoryforPreclinicalandBasicResearchonChronicDiseases;*Correspondingauthor,E-mail:xiulimen@126.com)

ObjectiveTo investigate the effects of ischemic postconditioning(I-postC) on kidney injury caused by tourniquet shock，and explore its possible mechanisms.MethodsThirty SD rats were randomly divided into control group，tourniquet shock group(TOS group) and I-postC group.The tourniquet shock animal models were induced by tourniquet.In I-postC group，ischemic postconditioning was performed based on the treatment in model group.Blood was taken from the abdominal aorta to measure the contents of blood creatinine(Cr)，blood urea nitrogen(BUN) and C-reactive protein(CRP) in plasma.The contents of superoxide dismutase(SOD)，malondialdehyde(MDA)，xanthine oxidase(XOD)，and myeloperoxidase(MPO) in renal tissues were determined.The expression of Bcl-2 protein and Bax protein in renal tissue was detected.The apoptotic cells in renal tissue were determined by terminal-deoxynucleotidyl trans-ferase-mediated d-UTP nick end labeling(TUNEL).The histological ultrastructure changes of renal tissues were observed under electron microscope.Results①Compared with control group，SOD activity in renal tissues reduced in TOS group and I-postC group(P<0.01),while the levels of Cr,BUN and CRP in plasma increased(P<0.01)，and the levels of MDA,XOD,MPO in renal tissues also increased(P<0.01).Compared with control group，Bax protein expression increased obviously in TOS group and I-postC group，and the antiapoptotic gene Bcl-2 expression increased slightly.The number of renal tubular epithelial cells and endothelial cell apoptosis increased in TOS group and I-postC group.Under the transmission electron microscope，there were renal proximal convoluted tubule epithelial cell nucleus pycnosis，intracellular cavitation，increased lysosome and dense particle deposition，and some mitochondria crest fracture or fuzzy.Glomerular podocyte protuberant，irregular，fusion，mitochondrial cristae fracture and reduced free bubble，rough endoplasmic reticulum expansion were also observed.②Compared with TOS group，SOD activity in renal tissues increased in I-postC group(P<0.05 orP<0.01)，while the levels of Cr，BUN and CRP all decreased(P<0.05 orP<0.01),and the number of renal cell apoptosis reduced(P<0.05 orP<0.01).Compared with TOS group，Bcl-2 protein expression increased and Bax was decreased in I-postC group.Under the transmission electron microscope，the structural damage was reduced in renal tubular epithelial cells and glomerulus.ConclusionTourniquet shock can induce renal dysfunction and structural damage，while I-postC can relieve the kidney damage by reducing the oxygen free radicals and inhibiting the inflammation.

tourniquet shock； kidney damage； ischemic postconditioning； apoptosis

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學研究重點課題資助項目(20130060)

趙利軍,女,1975-07生，碩士,副教授,E-mail:786411506@qq.com

2016-12-09

R363

A

1007-6611(2017)04-0328-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.006