曲 璇,李 軍,馬曉軍,韓洛川,史海龍

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室,咸陽 712046;*通訊作者,E-mail:quxuan519@163.com)

pSilencer 3.1-Sirt3基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

曲 璇*,李 軍,馬曉軍,韓洛川,史海龍

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室,咸陽 712046;*通訊作者,E-mail:quxuan519@163.com)

目的 構(gòu)建Sirt3基因的RNA干擾載體,并在真核細(xì)胞中進(jìn)行pSilencer 3.1-Sirt3的功能鑒定。 方法 利用體外DNA合成技術(shù)及液相色譜純化技術(shù)合成Sirt3干擾序列,通過酶切將干擾序列連接至pSilencer 3.1載體中,將陽性克隆載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞后,篩選陽性克隆,通過第二代體外DNA測序技術(shù)進(jìn)行序列測定。將測序正確的克隆用于Western blot實(shí)驗(yàn)和real time PCR實(shí)驗(yàn),以對其在真核細(xì)胞中的正確表達(dá)和內(nèi)源性Sirt3的干涉效果進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 PCR擴(kuò)增得到序列測定結(jié)果與干擾序列完全一致。構(gòu)建的pSilencer 3.1-Sirt3質(zhì)粒在AGS和SGC-7901細(xì)胞中進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)染,pSilencer 3.1-Sirt3能夠有效抑制內(nèi)源性Sirt3的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。 結(jié)論 成功構(gòu)建獲得Sirt3干擾載體,并有效降低Sirt3的mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá),為今后Sirt3的功能研究提供良好的基礎(chǔ)。

Sirtuin-3; RNA干擾; 載體構(gòu)建

自從20世紀(jì)70年代在酵母中首次發(fā)現(xiàn)兩種組蛋白去乙?；敢詠?組蛋白乙酰化和去乙?；难芯吭絹碓绞艿疥P(guān)注。近年來,人們發(fā)現(xiàn)去乙酰化酶Sirtuin-3(Sirt3)具有依賴于NAD的組蛋白去乙酰化酶活性,能夠?qū)σ阴；木€粒體蛋白進(jìn)行脫乙?；鵞1-3]。目前已發(fā)現(xiàn)Sirt3主要定位于肝、腦、腎和心臟等富含線粒體的組織器官中[3,4],Sirt3的作用底物有AceCS2、琥珀酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶等重要的能量代謝相關(guān)酶類,這對于維持和調(diào)節(jié)線粒體的正常生理功能具有重要意義[5,6]。大量研究表明,Sirt3可能與細(xì)胞生長、衰老、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、DNA的損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[2,7,8]。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded RNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá),誘發(fā)的特定基因沉默的過程。RNAi技術(shù)可造成特異性基因沉默,廣泛應(yīng)用于基因功能研究中。

因此,基于Sirt3對細(xì)胞的重要意義,本研究構(gòu)建了針對人Sirt3基因的特異性短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表達(dá)載體,并觀察了其在胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901中對Sirt3基因表達(dá)的抑制作用。這對于進(jìn)一步研究Sirt3與疾病發(fā)生的關(guān)系、解讀相關(guān)機(jī)制、探討其生物學(xué)功能均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

HEK293、AGS和SGC-7901細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫,由本實(shí)驗(yàn)室凍存;大腸桿菌XL10由第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈;干擾質(zhì)粒pSilencer 3.1-H1 neo及pSilencer 3.1陰性對照載體購自Ambion公司,BamHⅠ和HindⅢ等限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶均購自TaKaRa;質(zhì)粒提取試劑盒及凝膠回收純化試劑盒均購自U-gene公司;Sirt3單克隆抗體為CST公司產(chǎn)品。

1.2 人Sirt3基因特異性RNAi片段的設(shè)計(jì)及合成

采用Vector NTI 5.0軟件,根據(jù)人Sirt3的cDNA序列和干擾載體的設(shè)計(jì)要求,設(shè)計(jì)3對siRNA寡核苷酸鏈(Sirt3-938:5′-CUUGCUGCUGUGGUUGAUTT-3′;Sirt3-1211:5′-GCUUGAUGGACCAGACAAATT-3′;Sirt3-2419:5′-GCGCCUUAAUAAGAACAAATT-3′)。序列由上海生工生物工程公司合成。

1.3 人Sirt3基因siRNA干擾序列的鑒定

將合成的3對Sirt3的siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901,按LipofectAMINE2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。將5×105個AGS和SGC-7901細(xì)胞/每孔接種于6孔板,接種后24 h取三對100 nmol/L siRNA序列分別與10 μl的LipofectAMINE2000混勻,進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h,收集蛋白檢測Sirt3蛋白水平的表達(dá)。

1.4 pSilencer 3.1-Sirt3載體的構(gòu)建

1.5 LipofectAMINE2000瞬時轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞

按LipofectAMINE2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。將AGS和SGC-7901細(xì)胞5×105個/孔接種于6孔板,接種后24 h,取4 μg陰性對照空載體、pSilencer 3.1-Sirt3質(zhì)粒分別與10 μl的LipofectAMINE2000混勻,20 min后進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。

1.6 Western blot檢測Sirt3的蛋白水平表達(dá)

分別收集25 cm2培養(yǎng)瓶中陰性對照組、pSilencer 3.1-Sirt3干擾組的細(xì)胞樣品,用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取蛋白進(jìn)行定量,加入5×SDS凝膠加樣緩沖液,煮沸5 min,按照蛋白定量結(jié)果進(jìn)行加樣,行12% SDS-PAGE凝膠電泳,采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。將NC膜用5%脫脂奶封閉,分別加入Sirt3多抗(1 ∶1 000)和β-actin單抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,用山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1 ∶5 000),室溫孵育1 h,用ECL發(fā)光,膠片顯色,分析結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參照。

1.7 Real-time PCR檢測Sirt3的mRNA水平表達(dá)

按TRIzol試劑盒說明書分別提取AGS和SGC-7901細(xì)胞組、pcDNA3.1陰性對照載體、pcDNA3.1-Sirt3過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組樣品的總RNA。按說明書進(jìn)行RT-PCR,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈,Sirt3的擴(kuò)增引物(上游引物:5′-CCCCAAGCCCTTTTTCACTTT-3′;下游引物:5′-CGACACTCTCTC AAGCCCA-3′),PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94 ℃持續(xù)5 min,變性94 ℃ 30 s、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s,共30個循環(huán),72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內(nèi)參照(上游引物為5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,下游引物為5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′)。PCR擴(kuò)增條件同Sirt3擴(kuò)增條件相同。以上2對PCR引物均由上海生工生物工程公司合成。PCR結(jié)束后,將所得結(jié)果按照公式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 人Sirt3干擾序列對Sirt3蛋白水平表達(dá)的鑒定

相對于陰性對照組,Sirt3-938、Sirt3-1211和Sirt3-2419三組siRNA轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中,均有效抑制Sirt3蛋白表達(dá)(見圖1)。其中Sirt3-938干擾序列作用最明顯,可用于后期實(shí)驗(yàn)研究。

1-4.AGS細(xì)胞；5-8.SGC-7901細(xì)胞；1，5.陰性對照；2，6.轉(zhuǎn)染Sirt3-1211；3,7.轉(zhuǎn)染Sirt3-2419；4,8.轉(zhuǎn)染Sirt3-938圖1 Sirt3-938、Sirt3-1211 and Sirt3-2419降低Sirt3蛋白水平的表達(dá)Figure 1 Sirt3-938,Sirt3-1211 and Sirt3-2419 decreased the protein expression of Sirt3

2.2 人Sirt3基因真核干擾表達(dá)載體pSilencer 3.1-Sirt3的構(gòu)建和鑒定

合成的2條寡核苷酸鏈退火后形成雙黏端的雙鏈DNA片段,將該片段和pSilencer 3.1-H1 neo分別用BamHⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切。最終由T4DNA連接酶將兩者連接后,構(gòu)成質(zhì)粒pSilencer 3.1-Sirt3(構(gòu)建過程見圖2)。為了驗(yàn)證載體構(gòu)建是否正確,首先用內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ對pSilencer 3.1-Sirt3進(jìn)行酶切鑒定,在小于100 bp的位置觀察到目的片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,初步證明克隆構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,將得到的陽性菌株送上海生工生物工程技術(shù)公司測序,證實(shí)干擾序列成功插入載體中,pSilencer 3.1-Sirt3干擾載體構(gòu)建成功。

圖2 pSilencer3.1-Sirt3載體的構(gòu)建Figure 2 The construction of pSilencer3.1-Sirt3

2.3 實(shí)時定量PCR檢測Sirt3的mRNA表達(dá)水平

按TRIzol試劑盒說明書分別提取AGS和SGC-7901細(xì)胞組、陰性對照載體、pSilencer 3.1-Sirt3轉(zhuǎn)染組樣品的總RNA。按說明書進(jìn)行RT-PCR,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈,Sirt3的擴(kuò)增引物(上游引物:5′-CCGCGGTACCATGGCGTTCTGGGGTTG-3′;下游引物:5′-CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC-3′)。PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 30 s、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s,共30個循環(huán),72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內(nèi)參照。PCR結(jié)束后,將所得結(jié)果按照公式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示Sirt3干擾載體有效降低Sirt3的mRNA水平(見圖3)。

與對照組比較，*P<0.000 1圖3 pSilencer 3.1-Sirt3在AGS和SGC-7901細(xì)胞均能夠顯著降低Sirt3mRNA的表達(dá)Figure 3 The pSilencer 3.1-Sirt3 down-regulated the mRNA level of Sirt3 in both AGS and SGC-7901 cells

2.4 Western blot檢測Sirt3蛋白水平的表達(dá)

結(jié)果表明,干擾載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的Sirt3蛋白的表達(dá)水平明顯受到抑制(見圖4)。這與RNA水平的檢測結(jié)果一致,證實(shí)Sirt3干擾載體在兩種腫瘤細(xì)胞中有效地抑制了Sirt3的蛋白表達(dá)。以上結(jié)果證明Sirt3干擾載體構(gòu)建成功,可用于后期實(shí)驗(yàn)研究。

1.AGS陰性對照； 2.AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSilencer 3.1-Sirt3;3.SGC-7901陰性對照；4.SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSilencer-3.1-Sirt3圖4 pSilencer 3.1-Sirt3降低Sirt3的蛋白水平的表達(dá)Figure 4 The pSilencer 3.1-Sirt3 down-regulated the protein level of Sirt3

3 討論

Sirt3是唯一在遺傳學(xué)上與人的壽命相關(guān)的成員,由于其主要在線粒體定位,因此具有特殊的研究意義[9]。許多研究表明,在應(yīng)激條件或細(xì)胞膜去極化條件下,Sirt3會促進(jìn)線粒體有氧氧化功能,對于細(xì)胞的生存和維持能量的供應(yīng)必不可缺[7,10]。Sirt3在組織器官中的表達(dá)缺陷或突變則與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān),如心臟功能缺陷、神經(jīng)退行性病變等[11,12]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要因素,目前認(rèn)為,Sirt3主要從三個方面清除內(nèi)源性ROS的水平:Sirt3可以通過去乙?；姆绞街苯蛹せ畛趸锲缁?(superoxide dismutase 2,SOD2),清除ROS[13,14];Sirt3通過增強(qiáng)電子傳遞鏈的功能,提高ATP生成效率,減少ROS生成[15,16];Sirt3通過激活轉(zhuǎn)錄因子FOXO3A活性,促進(jìn)抗氧化因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[17,18]。此外,最新的研究發(fā)現(xiàn)Sirt3在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制也成為科學(xué)界的一個研究重點(diǎn)[19]?，F(xiàn)已證實(shí)SIRT3在基因組穩(wěn)定性方面可能發(fā)揮重要的作用。另外,Sirt3還可以通過破壞HIF-1α的穩(wěn)定性來介導(dǎo)代謝重組,然后調(diào)節(jié)糖酵解基因的表達(dá),從而抑制腫瘤的發(fā)生,證明了Sirt3在細(xì)胞代謝中的重要作用[20]。因此,本研究首先篩選了三對Sirt3干擾序列,從中篩選Sirt3干涉效果最好的一對(Sirt3-938),并將該序列成功插入干涉載體中。結(jié)果顯示pSilencer3.1-Sirt3在真核細(xì)胞中有效降低內(nèi)源性Sirt3的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平,這對于進(jìn)一步研究Sirt3與疾病發(fā)生的關(guān)系、解讀相關(guān)機(jī)制、探討其生物學(xué)功能均具有重要意義。

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Construction and biological function identification of pSilencer 3.1-Sirt3 vector

QU Xuan*,LI Jun,MA Xiaojun,HAN Luochuan,SHI Hailong

(ShaanxiUniversityofChineseMedical,Xianyang712046,China;*Correspondingauthor,E-mail:quxuan519@163.com)

ObjectiveTo construct the Sirt3 interference vector, and verify its biological function in mammal cells.MethodsThe Sirt3 interference sequence was synthesized byinvitroDNA synthetic technology and liquid chromatogram purification assay. The fragments were inserted into pSilencer 3.1 by digestion and DNA ligation. The resulted plasmid was transformed into competentEscherichiacolicells. The positive clone was selected and sequenced with the second DNA sequencing technology. The correct plasmid was used to observe its expression in eukaryotic cells and the invention efficacy of endogenous Sirt3 by Western blot and real time PCR assays.ResultsThe sequence of the pSilencer 3.1-Sirt3 was consistent with that of the Sirt3 interference sequence. After the pSilencer 3.1-Sirt3 vector was transfected into AGS and SGC-7901 cells, the endogenous Sirt3 mRNA and protein expression was inhibited.ConclusionThe construction of pSilencer 3.1-Sirt3 vector is successfully obtained. The vector of pSilencer 3.1-Sirt3 can efficiently decrease the mRNA and protein expression of Sirt3. The results may provide a basis for the further studies on the roles of Sirt3.

Sirtuin-3(Sirt3); RNA interference; vector construction

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81502370)

曲璇,女,1983-05生,博士,講師,E-mail:quxuan519@163.com

2017-03-02

Q789

A

1007-6611(2017)07-0650-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.003