陳 雙, 劉 春 瑩, 王 亞 芳, 魚(yú) 紅 閃, 金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

從三七莖葉皂苷中分離純化人參皂苷C-Mx1和Rb3

陳 雙, 劉 春 瑩, 王 亞 芳, 魚(yú) 紅 閃, 金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

利用兩步硅膠柱層析法，從三七莖葉皂苷中分離純化人參皂苷Rb3和C-Mx1單體。30 g三七莖葉皂苷，經(jīng)分離得到純度為50%～60%的粗品C-Mx1 4.66 g和Rb3 8.58 g；將C-Mx1和Rb3粗品皂苷進(jìn)行二次硅膠柱分離，得到純度為95%的C-Mx1單體0.92 g和Rb3單體3.1 g。以核磁共振法證明了分離產(chǎn)物為C-Mx1和Rb3皂苷。

人參皂苷C-Mx1；人參皂苷Rb3；三七莖葉皂苷

0 引 言

三七的主要活性成分為皂苷，已發(fā)現(xiàn)三七中有人參皂苷70余種，其中三七根中90%以上的皂苷為Rg1、Rb1和Re人參皂苷，三七莖葉中含有Rb3、C-Mx1、Rc、Rb1等幾十種皂苷[1-2]。目前人參莖葉的藥用功效已進(jìn)入藥典，但三七莖葉的藥用功效仍未進(jìn)入藥典，且利用率很低。三七莖葉皂苷Rb3、C-Mx1等在治療心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)方面具有較高的功效[3-4]。

目前，有關(guān)從三七莖葉中分離皂苷單體的報(bào)道很多。饒高雄等[5]用硅膠柱、Rp-18柱、葡聚糖凝膠LH-柱等三步柱層析方法，從100 g三七莖葉皂苷中分離得到2.1 g人參皂苷Rb3；韓金玉等[6]采用大孔吸附樹(shù)脂法和正相液相色譜法，建立了人參皂苷Rb3的制備工藝，得到Rb3的純度為90%；劉翀等[7]以三七莖葉提取物為原料，采用反相液相色譜技術(shù)分離純化人參皂苷Rb3，得到了純度為90%的Rb3；還有利用膠束電動(dòng)色譜法等方法分離單體皂苷的報(bào)道[8]；但是，這些方法步驟煩瑣，或者需要昂貴的儀器設(shè)備。

本實(shí)驗(yàn)利用最通常的硅膠柱、改變洗脫劑極性等方法，從三七莖葉皂苷中分離提純C-Mx1和Rb3皂苷單體，并用核磁共振方法核對(duì)了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，為大量制備C-Mx1和Rb3皂苷單體提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

三七莖葉皂苷，遼寧桓仁陽(yáng)光保健品有限公司；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1等，天津天宿光華、天樂(lè)集團(tuán)；薄層層析板Silica gel 60-F254，德國(guó)Merck公司；硅膠，青島海洋化工廠。

1.2 方 法

1.2.1 硅膠柱分離三七莖葉皂苷

第一次硅膠柱分離：向30 g的三七莖葉皂苷中加20 mL體積比為9∶1的氯仿-甲醇混合液，再加入80～100目硅膠75 g(樣品質(zhì)量的2.5倍)，攪拌均勻；裝入300～400目硅膠550 g(樣品質(zhì)量的16～20倍)作分離膠，上面裝入樣品膠。

先用1～2 L純氯仿通柱，然后用體積比為7.5∶2.5∶0.2的氯仿-甲醇-水洗脫劑洗脫硅膠柱，用三角瓶分別收集洗脫液，每瓶200 mL，依次標(biāo)記好瓶號(hào)；用TLC方法檢測(cè)洗脫液，分別合并C-Mx1 和Rb3；減壓蒸干，得到C-Mx1和Rb3粗品。

第二次硅膠柱分離：將C-Mx1和Rb3粗品，按相同方法制備樣品膠，裝硅膠柱；用極性略低的洗脫液，分別洗脫分離單體皂苷。

C-Mx1皂苷的分離：用體積比為8∶2的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫，用250 mL三角瓶分別收集洗脫液(150～200 mL)，洗脫至不再含有C-Mx1皂苷；用TLC檢測(cè)，合并C-Mx1純單點(diǎn)的洗脫液，蒸干得到C-Mx1單體。

Rb3皂苷的分離：用體積比為7.8∶2.2∶0.1 的氯仿-甲醇-水洗脫劑洗脫，收集方法與C-Mx1 方法相同。

1.2.2 薄層層析法(TLC)

用毛細(xì)管吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品皂苷溶液，在薄層層析板上點(diǎn)樣、吹干。展開(kāi)劑為體積比7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水，用10%硫酸加熱顯色。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC)

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品制備：分別稱取1 mg人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Fa、Rb1、Fc、Rc、Rb3、Rd、Gyp-17、C-Mc1、C-Mx1，溶于1 mL甲醇中，配制成人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

色譜儀，Waters 2695高效液相色譜分析儀，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器及Empower色譜工作站進(jìn)行檢測(cè)。Knauer C18色譜柱(5 μm， 250 mm×3 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)；0～20 min，20% A等度；20～31 min，20%～32% A線性梯度；31～40 min，32%～43% A線性梯度；40～70 min，43%～100% A線性梯度；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，35 ℃；體積流量，0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)，203 nm。

1.2.4 核磁共振法(NMR)

將三七莖葉皂苷所分離的單體皂苷，用核磁共振(NMR)法檢測(cè)其化學(xué)結(jié)構(gòu)。NMR波譜，采用瑞士Bruke AVANCE 600超導(dǎo)核磁共振波普儀進(jìn)行測(cè)定；1H NMR譜的觀測(cè)頻率為600 MHz，13C NMR譜的觀測(cè)頻率為150 MHz；探頭，5 mm BBO；溶劑，Pyridine-D5[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 市銷三七莖葉皂苷成分分析

稱取三七莖葉皂苷4 mg，溶于1 mL色譜純甲醇中，經(jīng)HPLC檢測(cè)，與人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1相比較，結(jié)果如圖1所示。

圖1 三七莖葉皂苷的HPLC

從圖1可以看到，市銷的三七莖葉皂苷中，主要含人參二醇類皂苷Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1等，人參三醇類皂苷含量較低。圖1的各皂苷含量如表1所示。

由圖1和表1可知，三七莖葉皂苷中含量最高的皂苷為Rb3(30%)，其次是C-Mx1(17%)，因此，可以通過(guò)硅膠柱法從三七莖葉皂苷中分離Rb3和C-Mx1單體。

2.2 硅膠柱分離純化C-Mx1和Rb3

2.2.1 C-Mx1和Rb3粗品的分離

用體積比為7.5∶2.5∶0.2的氯仿-甲醇-水洗脫劑進(jìn)行洗脫，共收集79瓶，合并得到11種物質(zhì)。1，1～28瓶，3.18 g；2，29～30瓶，0.32 g；3，31～36瓶，1.36 g；4，37～42瓶，2.75 g；5，43～45瓶，1.91 g；6，46～51瓶；7，52瓶，0.75 g；8，53瓶，3.08 g；9，56～65瓶，5.50 g；10，66～73瓶，3.08 g；11，74～79瓶，2.06 g。經(jīng)TLC檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

表1 HPLC檢測(cè)三七莖葉中不同皂苷的出峰時(shí)間及峰面積比

Tab.1 Different ginsennoside contents in notoginseng leaf determined by HPLC

皂苷t/min峰面積比/%1Fa36．1026．862Rb137．1484．893Fc37．64514．364Rc37．99311．165Rb338．77130．126Rd40．3522．667Gyp1741．2872．058C-Mc142．4895．889C-Mx143．21717．18

原，三七莖葉皂苷；Rb3、C-Mx1，Rb3、C-Mx1標(biāo)準(zhǔn)品

從圖2中可以看到，分離物4和5中，C-Mx1皂苷含量最高，分別為2.75和1.91 g，共4.66 g；分離物7、8、9中Rb3含量最高，共8.58 g；即得到C-Mx1粗品4.66 g、Rb3粗品8.58 g。

C-Mx1粗品和Rb3粗品經(jīng)HPLC檢測(cè)，如圖3所示。經(jīng)計(jì)算，C-Mx1和Rb3皂苷純度均為50%，質(zhì)量分別為2.33和4.29 g。

2.2.2 C-Mx1和Rb3單體的分離

按“1.2.1”方法分別分離純化C-Mx1和Rb3，得到0.92 g C-Mx1單體和3.1 g Rb3單體，得率為3.1%和10%。經(jīng)檢測(cè)，純度均為95%，HPLC結(jié)果如圖4所示。

2.3 NMR鑒定C-Mx1和Rb3的化學(xué)結(jié)構(gòu)

對(duì)分離得到的人參皂苷C-Mx1和Rb3分別進(jìn)行1H NMR、13C NMR等核磁共振圖譜檢測(cè)。

(a) C-Mx1

(b) Rb3

圖3 從三七莖葉皂苷分離的C-Mx1粗品和Rb3粗品的HPLC

Fig.3 Crude C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides determined by HPLC

(a) C-Mx1

(b) Rb3

圖4 經(jīng)分離提純的C-Mx1和Rb3單體的HPLC

Fig.4 HPLC of pure ginsenoside C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides

通過(guò)與文獻(xiàn)[10-11]中人參皂苷核磁數(shù)據(jù)比對(duì)分析，確認(rèn)了從三七莖葉皂苷分離得到的人參皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)，證明了分離得到的產(chǎn)物為人參皂苷C-Mx1和Rb3單體。13C NMR數(shù)據(jù)及其結(jié)構(gòu)歸屬如表2所示。由表2可以確認(rèn)，從三七莖葉皂苷分離得到物質(zhì)是人參皂苷C-Mx1和Rb3單體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

因此，人參皂苷C-Mx1系統(tǒng)名稱為3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol。中文名稱為3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基]-20-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20(S)-人參二醇苷元。

Rb3的系統(tǒng)命名稱為3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)- protopanaxadiol。中文為3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20(S)-人參二醇苷元。

表2 分離純化的人參皂苷C-Mx1和Rb3的13C NMR數(shù)據(jù)及其結(jié)構(gòu)歸屬

(a) C-Mx1

(b) Rb3

圖5 C-Mx1和Rb3單體皂苷結(jié)構(gòu)式

Fig.5 Structures of pure ginsenoside C-Mx1 and Rb3

3 結(jié) 論

市銷的三七莖葉皂苷中主要含有皂苷Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1等，其中含量最高的皂苷為Rb3，其次為C-Mx1皂苷。從30 g三七莖葉皂苷中，成功地分離得到純度95%的C-Mx1單體皂苷0.92 g，得率為3.1%；分離得到純度95%的Rb3單體皂苷3.1 g，得率為10%。用NMR法鑒定了產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)其為人參皂苷單體C-Mx1和Rb3。

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Separated and purified ginsenoside C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides

CHEN Shuang, LIU Chunying, WANG Yafang, YU Hongshan, JIN Fengxie

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

The ginsenoside C-Mx1 and Rb3 were isolated and purified from notoginseng leaf ginsenosides. 30 g notoginseng leaf ginsenosides were isolated, from which 50%-60% crude C-Mx1 of 4.66 g and Rb1 of 8.58 g were obtained. 95% pure C-Mx1 of 0.92 g and Rb3 of 3.1 g were obtained from 4.66 g crude C-Mx1 and 8.58 g crude Rb3. The separation products were C-Mx1 and Rb3 saponins determined by13C NMR.

ginsenoside C-Mx1; ginsenoside Rb3; notoginseng leaf ginsenosides

2015-12-30.

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003)；國(guó)家高端外國(guó)專家項(xiàng)目(GDT20152100019).

陳 雙(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：魚(yú)紅閃(1968-)，男，教授.

TS201.2

A

1674-1404(2017)04-0255-05

陳雙,劉春瑩,王亞芳,魚(yú)紅閃,金鳳燮.從三七莖葉皂苷中分離純化人參皂苷C-Mx1和Rb3[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(4):255-259.

CHEN Shuang, LIU Chunying, WANG Yafang, YU Hongshan, JIN Fengxie. Separated and purified ginsenoside C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 255-259.