孫 世 廣， 李 傲 婷， 唐 越， 孫 娜， 于 翠 平， 吳 海 濤

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116034 )

櫛孔扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物特性

孫 世 廣， 李 傲 婷， 唐 越， 孫 娜， 于 翠 平， 吳 海 濤

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116034 )

以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶為工具酶，制備櫛孔扇貝裙邊酶解物。研究了酶解物的水解度(DH)、肽分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、酶解物及美拉德產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力。結(jié)果表明，加酶量3 000 U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，酶解時(shí)間3 h，經(jīng)中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解獲得的酶解物水解度分別達(dá)到了37.6%和19.2%。酶解物中的肽分子質(zhì)量以3 ku以下為主，其中木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物占59.7%～67.6%，中性蛋白酶水解產(chǎn)物占64.5%～78.2%。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解物對(duì)DPPH的清除能力逐漸提高。經(jīng)美拉德反應(yīng)后，IC50降低到酶解物的1/17～1/36，抗氧化能力顯著提高。

櫛孔扇貝；裙邊；酶解物；抗氧化；美拉德反應(yīng)

0 引 言

扇貝作為我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)貝類，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年全國(guó)扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)量近165萬(wàn)t[2]。櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)是我國(guó)北方最重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一，隨著扇貝養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，扇貝加工量也隨之增加。扇貝柱產(chǎn)品在生產(chǎn)和加工過(guò)程中，產(chǎn)生大量低值副產(chǎn)物，如扇貝裙邊，約占活體扇貝質(zhì)量的9%[3]，富含蛋白質(zhì)，是開發(fā)活性肽的良好來(lái)源。

天然蛋白水解物由于具有抗氧化活性一直受到廣泛關(guān)注[4]。以蛋白水解物或多肽為原料，通過(guò)與還原糖熱反應(yīng)，研究其美拉德反應(yīng)特性，并發(fā)現(xiàn)抗氧化活性得到較大提高[5]。目前，有關(guān)櫛孔扇貝裙邊的研究主要集中于脂肪酸組成分析[6]、多糖的生物活性研究[7]、酶解肽的生物活性[8]、利用裙邊開發(fā)調(diào)味品[9]等，有關(guān)櫛孔扇貝裙邊酶解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究以櫛孔扇貝裙邊為原料，以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶為工具酶，制備櫛孔扇貝裙邊酶解物，在明確酶解物的肽分子質(zhì)量分布、氨基酸組成的基礎(chǔ)上，研究櫛孔扇貝裙邊酶解物與核糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，其產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力，為櫛孔扇貝裙邊的高效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原 料

新鮮櫛孔扇貝，2015年3月購(gòu)自大連長(zhǎng)興市場(chǎng)，清洗后取裙邊，沸水浴10 min熱變性處理，冷凍干燥、粉碎后獲得櫛孔扇貝裙邊凍干粉，于-18 ℃冷凍保存。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備

木瓜蛋白酶、Cytochrome C (12.5 ku)、Aprotinin (6.5 ku)、二甘氨酰甘氨酸(0.19 ku)、丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、N,N-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、巰基乙醇等，上海生工生物工程有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，寶生物工程(大連)有限公司；中性蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；Vitamin B12 (1.3 ku)、還原型谷胱甘肽(0.3 ku)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氨基酸衍生化溶液，依利特公司；其他試劑均為生化試劑或分析純。

AE-6450垂直電泳儀槽，日本ATTO；MF-ChemiBIS 2.0凝膠成像儀，DNR Bio-imaging；P230半制備高效液相色譜、P1201高效液相色譜，大連依利特分析儀器有限公司；SuperdexTM Peptide 10/300 GL凝膠過(guò)濾色譜柱，GE Healthcare公司；Infinite200 NANO酶標(biāo)定量測(cè)定儀，TECAN；SZF-106A粗脂肪測(cè)定儀，上海新嘉電子有限公司；KDN-103F自動(dòng)定氮儀，上海纖檢儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 SDS-PAGE電泳檢測(cè)

取一定量新鮮櫛孔扇貝裙邊，加入等體積5×上樣緩沖液(250 mmol/mL，pH 7.5的Tris-HCl緩沖液，8 mol/mL尿素，5% SDS，5%巰基乙醇)，100 ℃煮沸5 min，振蕩過(guò)夜，16 500g離心后取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.2 化學(xué)組成分析

蛋白含量測(cè)定采用凱式定氮法，脂肪含量測(cè)定采用GB 5009.6—2003索式抽提法，總糖含量測(cè)定采用苯酚硫酸法，灰分測(cè)定采用GB 5009.4—2010方法，水分測(cè)定采用GB 5009.3—2010直接干燥法。

1.2.3 酶解工藝

分別采用中性蛋白酶(204.3 kU/g)和木瓜蛋白酶(214.8 U/g)對(duì)櫛孔扇貝裙邊凍干粉進(jìn)行酶解，酶解條件：加酶量3 000 U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，恒定pH 7.0，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間分別為0.5、1、2、3 h，酶解后沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液冷凍干燥，粉碎后密封，-18 ℃冷凍保存。

1.2.4 水解度的測(cè)定

采用pH-stat法，以滴定所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積，計(jì)算水解度。

DH=Vc/mαbt×100%

式中：DH為水解度，%；V為NaOH體積，mL；c為NaOH濃度，mol/L；m為底物中蛋白總量，g；bt為底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g，本研究中以7.5計(jì)；α為水解過(guò)程中α-氨基的解離度。

1.2.5 分子質(zhì)量分布

將樣品溶于超純水中，質(zhì)量濃度為2 mg/mL，過(guò)0.45 μm微孔膜后，分子質(zhì)量分布范圍采用P230半制備高效液相色譜匹配SuperdexTM Peptide 10/300 GL凝膠過(guò)濾色譜柱測(cè)定。進(jìn)樣量25 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相超純水、乙腈、三氟乙酸的體積比為70∶30∶0.1，洗脫體積流量0.4 mL/min。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用Cytochrome C(1.25 ku)，Aprotinin(6.5 ku)，Vitamin B12(1.35 ku)，還原型谷胱甘肽(0.3 ku)，二甘氨酰甘氨酸(0.19 ku)。對(duì)凝膠過(guò)濾色譜而言，分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(y)與保留時(shí)間(x)呈線性關(guān)系，經(jīng)過(guò)計(jì)算所得分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.077 2x+5.782 3(R2=0.990 1)。

1.2.6 總氨基酸測(cè)定

采用Elite-AAK氨基酸分析系統(tǒng)測(cè)定樣品的總氨基酸含量。取25 mg樣品于安培瓶中，加入3 mL 6 mol/L HCl或4 mol/L NaOH，作為兩種水解方式。封口后于110 ℃水解24 h。將水解后樣品移入蒸發(fā)皿，并在80 ℃水浴鍋中蒸干。用衍生緩沖液多次洗滌蒸發(fā)皿，洗液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，并用衍生緩沖液定容。0.45 μm膜過(guò)濾后，取5 mL溶液，加入25 mL棕色容量瓶中，再加入2.5 mL衍生化溶液。混勻后60 ℃水浴中暗反應(yīng)60 min，冷卻至室溫，用平衡緩沖液稀釋至刻度，靜置15 min，0.45 μm膜過(guò)濾后加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶后放入As 1201自動(dòng)進(jìn)樣器。

總氨基酸采用P1201高效液相色譜(依利特)匹配UV1201紫外檢測(cè)器測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。流動(dòng)相A為體積比1∶1的乙腈-水溶液，流動(dòng)相B為含有1% N,N-二甲基甲酰胺和0.41%流動(dòng)相B固體成分的去離子水(用冰醋酸調(diào)pH至6.4～6.8)。進(jìn)樣量10 μL，體積流量1.2 mL/min，柱溫27 ℃。

1.2.7 美拉德反應(yīng)

用去離子水配制櫛孔扇貝裙邊酶解物20 mg/mL 和核糖溶液40 mg/mL，將兩種溶液等體積混合，用0.1 mol/mL的NaOH將混合液pH調(diào)至7.0或8.0，分裝于4 mL旋蓋玻璃瓶中，置于干浴器中反應(yīng)，反應(yīng)溫度為95 ℃，反應(yīng)時(shí)間為12 h，反應(yīng)結(jié)束后，將美拉德反應(yīng)原液經(jīng)冷凍干燥后粉碎，-18 ℃冷凍保存。

1.2.8 DPPH自由基的清除

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，稍有調(diào)整：取1 mL 不同濃度多肽樣品溶液與2 mL pH 6.0 0.1 mol/mL 的磷酸鹽緩沖液，以及2 mL 200 μmol/L 的DPPH乙醇溶液混合均勻，漩渦振蕩后，室溫下避光靜置30 min。在2 000g轉(zhuǎn)速下離心15 min后，取上清液在517 nm測(cè)定其吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算公式：

X=(A0-A1)/(A0-A2)

式中：A1為樣品吸光度；A2為以95%乙醇代替DPPH溶液時(shí)測(cè)定的吸光度；A0為以去離子水代替樣品的吸光度。

1.2.9 DPPH自由基半抑制率(IC50)的計(jì)算

以扇貝裙邊酶解物或其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，DPPH清除率(%)為縱坐標(biāo)，采用Excel軟件作散點(diǎn)圖，并作線性回歸方程分析，獲得相關(guān)系數(shù)R2，R2大于0.85即代表可信，通過(guò)回歸方程，計(jì)算出DPPH自由基清除率為50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的扇貝裙邊酶解物或其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的濃度，即為DPPH自由基IC50。

2 結(jié)果和討論

2.1 新鮮櫛孔扇貝裙邊蛋白質(zhì)組成分析

采用“1.3.1”的方法提取櫛孔扇貝裙邊的總蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。由圖1可見(jiàn)，新鮮櫛孔扇貝裙邊主要的蛋白質(zhì)條帶主要有5條，其中在200 ku附近出現(xiàn)的條帶為肌球蛋白重鏈；在97 ku附近出現(xiàn)條帶為副肌球蛋白，它是無(wú)脊椎動(dòng)物特有的肌原纖維蛋白質(zhì)，與雙殼貝類閉殼肌的特殊運(yùn)動(dòng)有關(guān)；在40 ku左右的條帶為肌動(dòng)蛋白[9]。

HM，高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；LM，低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；2、4、8、16、32，櫛孔扇貝裙邊蛋白質(zhì)提取物分別稀釋2、4、8、16及32倍的樣品

圖1 新鮮櫛孔扇貝裙邊蛋白質(zhì)組成分析

Fig.1 Compositions of proteins from fresh scallopChlamysfarreriskirt

2.2 凍干粉的主要化學(xué)組成分析

采用“1.3.2”的方法對(duì)櫛孔扇貝裙邊凍干粉的主要化學(xué)組成進(jìn)行測(cè)定，其粗蛋白、粗脂肪、總糖、灰分及水分含量見(jiàn)表1。由表1可知，櫛孔扇貝裙邊凍干粉中富含蛋白質(zhì)，粗蛋白含量最高。同時(shí)，櫛孔扇貝裙邊凍干粉中也含有一定量的糖、脂肪和灰分。結(jié)果表明，櫛孔扇貝裙邊是一種高蛋白含量的水產(chǎn)資源，是開發(fā)酶解物及活性肽的良好來(lái)源。

表1 櫛孔扇貝裙邊凍干粉主要化學(xué)組成

2.3 凍干粉的水解

采用“1.3.3”和“1.3.4”的方法酶解櫛孔扇貝裙邊凍干粉，并測(cè)定水解過(guò)程中水解度的變化情況，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，櫛孔扇貝裙邊的水解度不斷升高。在相同的酶解時(shí)間下，中性蛋白酶的DH高于木瓜蛋白酶。在酶解前30 min，兩種酶解條件的DH都快速上升；在30～120 min緩慢升高，120 min后趨于穩(wěn)定。當(dāng)酶解180 min時(shí)，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的DH分別達(dá)到了37.6%和19.2%。結(jié)果表明，利用中性蛋白酶酶解櫛孔扇貝裙邊干粉可獲得較高的酶解效率。

圖2 櫛孔扇貝裙邊凍干粉酶解過(guò)程中的水解度曲線

Fig.2 DH curves of freeze-dried scallopChlamysfarreriskirt powder in hydrolysis process

2.4 酶解物的分子質(zhì)量分布

采用“1.3.5”方法對(duì)8種酶解物的肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，經(jīng)木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解獲得的櫛孔扇貝裙邊酶解物，其主要組分分子質(zhì)量均分布在1～3 ku。對(duì)于木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，分子質(zhì)量大于5 ku的肽分子組分比例逐漸減少，而分子質(zhì)量小于3 ku的肽分子組分逐漸增多。對(duì)于中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，分子質(zhì)量大于1 ku的肽分子組分比例逐漸減少，而分子質(zhì)量小于1 ku的肽分子組分逐漸增多。很多研究顯示，分子質(zhì)量在3 ku以下的肽段活性較強(qiáng)，且肽鏈中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的含量較高時(shí)，其抗氧化活性也較為顯著[11]。酶解時(shí)間在0.5～3 h范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解物中分子質(zhì)量0.2～3 ku的肽組分比例逐漸增多，質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和分別達(dá)到59.7%～67.6%(木瓜蛋白酶)和64.5%～78.2%(中性蛋白酶)。結(jié)果表明，經(jīng)中性蛋白酶酶解獲得的櫛孔扇貝裙邊酶解物3 ku以下的肽組分比例較大，這與中性蛋白酶對(duì)櫛孔扇貝裙邊酶解的水解度較高相一致。

圖3 櫛孔扇貝裙邊酶解物的分子質(zhì)量分布

2.5 酶解物的氨基酸組成

以中性蛋白酶為工具酶，對(duì)櫛孔扇貝裙邊凍干粉酶解2 h，獲得酶解物。采用“1.3.6”方法測(cè)定其氨基酸組成，結(jié)果見(jiàn)表2。櫛孔扇貝裙邊酶解物中富含Asp、Glu、Gly、Leu、His及Lys，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過(guò)5%。酶解物中Ala、Val、Lys、Pro、Leu、His、Tyr及Met等氨基酸的抗氧化活性較強(qiáng)[12]，酶解物中這些抗氧化氨基酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到384.7 mg/g，說(shuō)明櫛孔扇貝裙邊酶解物具有一定的抗氧化能力。

表2 櫛孔扇貝裙邊酶解物的氨基酸組成

2.6 酶解物及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力

采用“1.3.7”的方法對(duì)櫛孔扇貝裙邊酶解物進(jìn)行美拉德反應(yīng)，進(jìn)一步采用“1.3.8”的方法評(píng)價(jià)酶解物及其美拉德產(chǎn)物的抗氧化能力，結(jié)果如表3所示。在一定濃度范圍內(nèi)，酶解物及其美拉德產(chǎn)物均具有一定的DPPH自由基清除能力，且清除能力與濃度成線性正比關(guān)系，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算IC50。從表3中可以看出，相同的酶解時(shí)間，中性蛋白酶酶解物清除DPPH的IC50比木瓜蛋白酶酶解物略低，抗氧化能力略強(qiáng)。同種酶的酶解物，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)DPPH的清除能力逐漸提高。酶解物經(jīng)美拉德反應(yīng)后，IC50降低到酶解物的1/17～1/36，抗氧化能力顯著提高。對(duì)于櫛孔扇貝裙邊酶解物而言，美拉德反應(yīng)過(guò)程中pH 7或8的條件對(duì)其抗氧化能力影響不大，總體而言pH 8條件下IC50略低。結(jié)果說(shuō)明，美拉德反應(yīng)是提高櫛孔扇貝裙邊酶解物的抗氧化能力的有效途徑。

表3 櫛孔扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力[以IC50衡量]

3 結(jié) 論

櫛孔扇貝裙邊凍干粉中主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，粗蛋白達(dá)到裙邊干基的(68.71±0.41)%，以中性蛋白酶及木瓜蛋白酶為工具酶酶解櫛孔扇貝裙邊凍干粉，中性蛋白酶水解效率較高。酶解物清除DPPH自由基IC50為10 mg/mL，美拉德產(chǎn)物清除DPPH自由基IC50為0.4 mg/mL，酶解物經(jīng)美拉德反應(yīng)后，其對(duì)DPPH的清除自由基能力明顯增強(qiáng)，提高了17～36倍，說(shuō)明美拉德反應(yīng)修飾是提高酶解肽抗氧化能力的一個(gè)有效的途徑。

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Characterization of protein hydrolysates and its Maillard reaction products from scallopChlamysfarreriskirt

SUN Shiguang, LI Aoting, TANG Yue, SUN Na, YU Cuiping, WU Haitao

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University， Dalian 116034, China )

The enzymatic hydrolysates were prepared from scallopChlamysfarreriskirt using neutral and papaya proteases. The degree of hydrolysis (DH), molecular weight distribution, amino acids composition and DPPH scavenging capacities of hydrolysates and their Maillard reaction products (MRPs) were estimated. The results showed that DH of hydrolysates treated with neutral and papaya proteases could reach to 37.6% and 19.2% in the condition of 3 000 U/g enzyme dosage and 4% substrate concentration for 3 h. The molecular weights of the peptides in the enzymatic hydrolysates were mainly below 3 ku, in which papaya proteases of 59.7%-67.6% and neutral proteases of 64.5%-78.2%, respectively. DPPH scavenging capacities of enzymatic hydrolysates increased with the hydrolysis period, and IC50of the enzymatic hydrolysates decreased to 1/17-1/36 after reaction.

scallopChlamysfarreri; skirt; enzymatic hydrolysates; antioxidant; Maillard reaction

2016-03-15.

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014026017)；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2015103020).

孫世廣(1990-)，男，碩士研究生;通信作者：吳海濤(1980-)，女，副教授.

TS254.9

A

1674-1404(2017)04-0240-05

孫世廣,李傲婷,唐越,孫娜,于翠平,吳海濤.櫛孔扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物特性[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(4):240-244.

SUN Shiguang, LI Aoting, TANG Yue, SUN Na, YU Cuiping, WU Haitao. Characterization of protein hydrolysates and its Maillard reaction products from scallopChlamysfarreriskirt[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 240-244.