李 冠 亨， 劉 春 瑩， 徐 龍 權(quán)， 林 完 澤， 魚 紅 閃

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.韓京國(guó)立大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 京畿道 安城 456-749 )

人參皂苷酶Ⅲ型轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc制備稀有皂苷C-Mc

李 冠 亨1， 劉 春 瑩1， 徐 龍 權(quán)1， 林 完 澤2， 魚 紅 閃1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.韓京國(guó)立大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 京畿道 安城 456-749 )

利用基因構(gòu)建克隆的E.coliC41菌產(chǎn)人參皂苷酶Ⅲ型，研究了酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc制備高活性稀有皂苷C-Mc的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷酶Ⅲ型先水解人參皂苷Rc的3-O-末端葡萄糖基生成C-Mc1，再水解C-Mc1的3-O-葡萄糖基生成C-Mc。人參皂苷酶Ⅲ型水解4.8 g的人參皂苷Rc，得到2.8 g 產(chǎn)物，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其純度為90%。經(jīng)核磁共振檢測(cè)，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為20-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖基-20(S)-二醇苷元，即C-Mc。

稀有人參皂苷；人參皂苷酶Ⅲ型；高效液相色譜；核磁共振

0 引 言

生曬參和西洋參中80%～90%的皂苷為Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1，這些人參皂苷在人體內(nèi)吸收率低、活性低[1-3]；而人參稀有皂苷C-K、Rh2、C-Mc等更容易被吸收，具有抗疲勞、抗癌等生理功能[4-6]。但是，生曬參中幾乎不含人參稀有皂苷。因此，將人參中含量高的皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1生物轉(zhuǎn)化制備成高活性的C-K、Rh2、C-Mc等人參稀有皂苷，對(duì)人參產(chǎn)業(yè)、新藥開發(fā)、保健食品和化妝品等具有重大意義[7-8]。

人參皂苷的轉(zhuǎn)化方法主要有化學(xué)法和酶法，這兩種方法都能使人參皂苷轉(zhuǎn)化成高活性的稀有皂苷。通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化的人參皂苷具有目的性差、產(chǎn)物龐雜、污染嚴(yán)重、難于下游分離純化等劣勢(shì)。酶法水解人參皂苷具有很多的優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)條件溫和，在常溫下即可反應(yīng)，反應(yīng)過程容易控制；有很強(qiáng)的底物專一性，產(chǎn)物單一，對(duì)環(huán)境沒有污染。李永淳等[9]用硅膠柱層析法，對(duì)前期采用生物酶轉(zhuǎn)化法制備并經(jīng)脫糖脫色處理過的粗品人參皂苷進(jìn)行了分離純化，得到了純度為82.2%的C-Mc。

為了酶轉(zhuǎn)化得到高活性人參稀有皂苷，本實(shí)驗(yàn)室相繼報(bào)道了4種特異的人參皂苷糖苷酶：人參皂苷糖苷酶Ⅰ型，能水解人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的第3(C)-O-和20(C)-O-多種糖基[10]；人參皂苷酶Ⅱ型，能水解原人參二醇類皂苷的20-O-多種糖基[11]；人參皂苷酶Ⅲ型，能水解原人參三醇類皂苷3-O-多種糖基[12]。本實(shí)驗(yàn)室與韓國(guó)林完澤教授合作研究，將新發(fā)現(xiàn)的Terrabacterginsenosidimutansgsoil 3082T菌種中的人參糖苷酶基因(bgl-gyp17)，克隆到E.coliC41(DE3)中表達(dá)，得到人參皂苷酶Ⅲ型，該酶能水解人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc的3-O-多種糖基[13]。

本實(shí)驗(yàn)利用已克隆表達(dá)的人參皂苷酶Ⅲ型，研究酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc制備高活性稀有皂苷C-Mc的方法，對(duì)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行核磁共振結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

人參皂苷Rc，本實(shí)驗(yàn)室提供；產(chǎn)人參皂苷酶Ⅲ型的基因工程菌，本實(shí)驗(yàn)室人員與林完澤教授共同構(gòu)建；薄層層析板Silica gel 60-F254，德國(guó)Merck公司；大孔樹脂AB-8，南開大學(xué)化工廠。

1.2 方 法

1.2.1 酶轉(zhuǎn)化Rc制備高活性人參稀有皂苷C-Mc

將4.8 g人參皂苷Rc溶解在200 mL的酶液中，在40 ℃搖床反應(yīng)2～24 h，用TLC檢測(cè)反應(yīng)程度，具體過程按參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

1.2.2 薄層層析法(TLC)檢測(cè)轉(zhuǎn)化率

展開劑配比為體積比為7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水溶液，10%硫酸加熱顯色。用BandScan軟件分析Rc轉(zhuǎn)化成C-Mc1和C-Mc的轉(zhuǎn)化率[15]。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)純度

色譜儀，Waters 2695高效液相色譜分析儀、Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器及Empower色譜工作站進(jìn)行檢測(cè)。Knauer C18色譜柱(5 μm, 250 mm×3 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，0～20 min，20%A等度；20～31 min，20%～32%A線性梯度；31～40 min，32%～43%A線性梯度；40～70 min，43%～100%A線性梯度。進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，體積流量0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

1.2.4 核磁共振分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

使用瑞士Bruke AVANCE 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀，對(duì)單體皂苷進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，包括一維1H、13C、DEPT譜，二維HSQC、HMBC、COSY譜檢測(cè)。1H檢測(cè)頻率為600 MHz，13C檢測(cè)頻率為150 MHz，使用5 mm NMR探頭，實(shí)驗(yàn)溫度25 ℃，濕度40%，溶劑Pyridine-D5，氫譜和碳譜均以Pyridine-D5為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 人參皂苷Rc的酶轉(zhuǎn)化及酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)pH

以人參皂苷Rc為底物，分別在pH 2～10條件下反應(yīng)8 h，TLC檢測(cè)相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，人參皂苷酶Ⅲ型酶的最適pH為6。

圖1 不同pH下的酶活力

2.1.2 反應(yīng)溫度

以人參皂苷Rc為底物，在pH=6條件下，分別在不同溫度下反應(yīng)8 h，TLC檢測(cè)相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，人參皂苷酶Ⅲ型酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃。

圖2 不同溫度下的酶活力

2.1.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

分別配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的人參皂苷Rc，在pH 6和40 ℃條件下反應(yīng)8 h，TLC檢測(cè)產(chǎn)物得率，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)產(chǎn)物得率最大。

圖3 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的產(chǎn)物得率

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間

在pH 6、反應(yīng)溫度為40 ℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的條件下，每4 h取樣一次，TLC檢測(cè)，計(jì)算人參皂苷C-Mc的得率，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，反應(yīng)時(shí)間為24 h時(shí)C-Mc的得率最大。

圖4 不同時(shí)間下的產(chǎn)物得率曲線

2.2 人參皂苷Rc到C-Mc的酶轉(zhuǎn)化過程

將25 mL酶液放入250 mL三角瓶中，再加入0.5 g人參皂苷Rc溶解，在最適反應(yīng)條件下，反應(yīng)2、3、10、20 h，各取樣0.2 mL，加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng)，TLC結(jié)果如圖5所示。

Rc，反應(yīng)底物；1、2、3、4，反應(yīng)2、3、10、20 h的產(chǎn)物；C-Mc、C-Mc1，混合的標(biāo)準(zhǔn)品

圖5 人參皂苷Rc不同酶反應(yīng)時(shí)間的TLC結(jié)果

Fig.5 TLC result of enzyme reaction of ginsenoside Rc at different time

從圖5中可以看到，人參皂苷Rc酶反應(yīng)2 h時(shí)，40%～45%的Rc轉(zhuǎn)化為C-Mc1；反應(yīng)3 h時(shí)，80%以上的Rc轉(zhuǎn)化為C-Mc1，同時(shí)有少量C-Mc產(chǎn)生；酶反應(yīng)10 h時(shí)，幾乎全部的Rc轉(zhuǎn)化為C-Mc1 和C-Mc，其比例約35∶65；酶反應(yīng)20 h時(shí)，95%以上的產(chǎn)物為C-Mc，C-Mc1含量很低。

由此可見，人參皂苷酶Ⅲ型，首先水解人參皂苷Rc的3-O-末端葡萄糖基生成C-Mc1，反應(yīng)速度較快；再水解C-Mc1的3-O-葡萄糖基生成C-Mc，反應(yīng)速度相對(duì)慢。由此可以得到酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc的反應(yīng)方式，如圖6所示。

2.3 人參皂苷Rc的酶轉(zhuǎn)化制備稀有皂苷C-Mc

由圖5可知，酶反應(yīng)20 h時(shí)，Rc的主要產(chǎn)物是C-Mc，因此反應(yīng)24 h，主要反應(yīng)產(chǎn)物是人參稀有皂苷C-Mc。按“1.2.2”的方法，4.8 g的人參皂苷Rc經(jīng)酶轉(zhuǎn)化，并經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化處理得到2.8 g的C-Mc，產(chǎn)物得率達(dá)58%。

圖6 人參皂苷酶Ⅲ型水解人參皂苷Rc的反應(yīng)式

純化得到的C-Mc，采用HPLC進(jìn)行純度檢測(cè)。以人參皂苷Rc為標(biāo)準(zhǔn)品，采用“1.2.4”的方法，以峰面積為y軸，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為x軸，得到標(biāo)準(zhǔn)方程為y=3×106x-16 915(R2=0.999 6)。采用相同的檢測(cè)條件，對(duì)純化得到的C-Mc進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。將峰面積帶入方程，計(jì)算得到產(chǎn)物C-Mc的純度為90%。

2.4 酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物C-Mc的結(jié)構(gòu)鑒定

取200 mg純度為90%的酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，用MeOH-H2O體系結(jié)晶重結(jié)晶得到C-Mc單晶，然后作核磁共振分析。結(jié)果與參考文獻(xiàn)[12]比對(duì)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的化學(xué)位移與文獻(xiàn)中C-Mc的化學(xué)位移相似，因此可以確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物C-Mc 核磁共振13C檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

圖7 產(chǎn)物人參稀有皂苷C-Mc的HPLC圖

表1 人參稀有皂苷C-Mc的 13C NMR化學(xué)位移和結(jié)構(gòu)歸屬

3 結(jié) 論

利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基因工程菌，對(duì)其產(chǎn)人參皂苷酶Ⅲ型，確定了最佳酶反應(yīng)條件：pH 6，反應(yīng)溫度40 ℃，最佳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，最佳反應(yīng)時(shí)間24 h。對(duì)人參皂苷酶Ⅲ型的酶反應(yīng)過程研究表明，該酶的反應(yīng)產(chǎn)物C-Mc是分兩步催化反應(yīng)產(chǎn)生的，第一步催化水解人參皂苷Rc的3-O-末端葡萄糖基生成C-Mc1，第二步再水解C-Mc1的3-O-葡萄糖基生成C-Mc。4.8 g人參皂苷Rc通過人參皂苷酶Ⅲ型轉(zhuǎn)化，經(jīng)AB-8樹脂吸附處理得到C-Mc 2.8 g，產(chǎn)物得率達(dá)58%，HPLC純度達(dá)90%。產(chǎn)物經(jīng)核磁共振檢測(cè)，確定結(jié)構(gòu)為20-O-α-L- 阿拉伯呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖基-20(S)-二醇苷元，即C-Mc。

在酶轉(zhuǎn)化制備C-Mc的研究中，采用AB-8樹脂進(jìn)行純化處理，得到產(chǎn)物純度達(dá)90%，操作快捷簡(jiǎn)單，無污染，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Preparation of minor ginsenoside C-Mc from ginsenoside Rc using special ginsenosidase type-Ⅲ

LI Guanheng1, LIU Chunying1, XU Longquan1, LIN Wanze2, YU Hongshan1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Life Science, Hankyong National University, Anseong 456-749, Korea )

To study the enzymatic conversion from ginsenoside Rc to the rare ginsenoside C-Mc with high active, the ginsenosidase Ⅲ was expressed from recombinantEscherichiacoliC41 and its enzymatic transformation processes were explored. The 3-O-glucopyranoside end of ginsenoside Rc was hydrolyzed to C-Mc1 by ginsenosidase Ⅲ, then C-Mc1 was transformed to C-Mc. 4.8 g ginsenoside Rc was hydrolyzed to 2.8 g products by ginsenosidase Ⅲ, of which purity could reach to 90% determined by HPLC. The result of NMR showed that its structure was 20-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol, that was C-Mc.

rare ginsenoside; ginsenosidase Ⅲ; HPLC; NMR

2015-12-09.

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003)；國(guó)家高端外國(guó)專家項(xiàng)目(GDT20152100019).

李冠亨(1992-)，男，碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-)，男，教授.

TS201.2；Q946.83

A

1674-1404(2017)04-0250-05

李冠亨,劉春瑩,徐龍權(quán),林完澤,魚紅閃.人參皂苷酶Ⅲ型轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc制備稀有皂苷C-Mc[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(4):250-254.

LI Guanheng, LIU Chunying, XU Longquan, LIN Wanze, YU Hongshan. Preparation of minor ginsenoside C-Mc from ginsenoside Rc using special ginsenosidase type-Ⅲ[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 250-254.