王學(xué)貴，余 婷，李 倩

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/無公害農(nóng)藥研究實驗室，四川 成都 611130)

光葉鐵仔提取物對小菜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響

王學(xué)貴，余 婷，李 倩

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/無公害農(nóng)藥研究實驗室，四川 成都 611130)

【目的】研究光葉鐵仔Myrsine stolonifera提取物對小菜蛾P(guān)lutella xylostella生長發(fā)育的影響。【方法】采用葉片載毒法，測定了光葉鐵仔根、莖、葉甲醇提取物和大孔吸附樹脂乙醇餾分對小菜蛾的生物活性；測定了大孔吸附樹脂乙醇餾分對小菜蛾生長發(fā)育的影響?！窘Y(jié)果】光葉鐵仔根、莖、葉甲醇提取物和大孔吸附樹脂乙醇餾分對小菜蛾具有胃毒作用，以葉部 50%(φ)乙醇餾分的效果較佳，72 h后校正死亡率達到75.56%。根莖部95%(φ)乙醇餾分與葉部50%(φ)乙醇餾分，對小菜蛾的幼蟲具有一定的拒食作用與體質(zhì)量抑制效果，其拒食率與體質(zhì)量抑制率整體高于90%，且對化蛹及羽化有一定的影響?！窘Y(jié)論】光葉鐵仔提取物對小菜蛾幼蟲具有較強的殺蟲活性，其活性成分及作用機理值得深入研究。

光葉鐵仔；提取物；小菜蛾；大孔吸附樹脂；生長發(fā)育；拒食活性

化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用在一定程度上緩解了農(nóng)業(yè)害蟲泛濫、糧食減產(chǎn)等問題，但長期單一使用易造成有害生物抗藥性、農(nóng)藥殘留等問題[1]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們對食品質(zhì)量與環(huán)境安全要求越來越高，對我國農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用提出了更嚴(yán)格的要求[2]。2015年我國農(nóng)業(yè)部提出到2020年農(nóng)藥零增長的行動方案，要求在控、替、精、統(tǒng)4個字上下功夫，其中“替”是關(guān)鍵，即用高效低劑量農(nóng)藥替代低效高劑量農(nóng)藥，綠色防控產(chǎn)品替代化學(xué)防治藥劑等。因環(huán)保、低毒、易降解等特點，植物源農(nóng)藥已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)研究與應(yīng)用的重點[3-4]。近年來，我國植物源農(nóng)藥的研究，尤其植物源殺蟲活性的研究報道較多，如大青葉Folium isatidis的正丁醇和石油醚提取物對小菜蛾P(guān)lutella xylostella具有較強的毒殺作用[5]，雷霽等[6]發(fā)現(xiàn)曼陀羅Datura stramonium水提取物對小菜蛾表現(xiàn)出拒食及毒殺活性；鄭如剛等[7]研究發(fā)現(xiàn)小桐子Jatropha curcas種子乙酸乙酯提取物對小菜蛾48 h校正死亡率達93.6%；Vanichpakorn等[8]研究發(fā)現(xiàn)藜蘆Veratrum nigrum根乙酸乙酯、乙醇和丙酮提取物對小菜蛾幼蟲均表現(xiàn)出殺蟲活性，其中乙酸乙酯對小菜蛾2齡和3齡幼蟲的LC50值分別為225和335 μg·mL–1。Cespedes等[9]從縐葉蒲包花菜Calceolaria integrifolia中提取的二萜、三萜和酚類物質(zhì)對豆象Callosobruchus maculatus和墨西哥豆瓢蟲Epilachna varivestis幼蟲表現(xiàn)出很強的殺蟲活性，在500 μg·cm–2用量下可致使豆象幼蟲死亡率達到40%～81%，可致墨西哥瓢蟲幼蟲死亡率達到35.0%～88.9%。Pugazhvendan等[10]研究發(fā)現(xiàn)艾草Artemisia argyi正己烷提取物對赤擬谷盜 Tribolium castaneum的活性最強，72 h的校正死亡率達到58%，灰毛豆Tephrosia purpurea乙酸乙酯提取物殺蟲活性次之，72 h的校正死亡率達到52%。植物源殺蟲劑的活性成分除直接利用外，還可以作為合成新型殺蟲劑的先導(dǎo)化合物，如氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑[1]、氯化煙酰類和魚尼丁受體類殺蟲劑[11]。

光葉鐵仔Myrsine stolonifera為紫金?？芃yrsinaceae鐵仔屬Myrsine植物，是我國臺灣、福建、浙江等地分布的一種常綠灌木[12]。前期研究表明，其甲醇提取物處理家蠅Musca domestica、蚜蟲Aphidoidea、白紋伊蚊Aedes albopictus等均表現(xiàn)出較高的殺蟲活性[13]，而鮮見其對小菜蛾P(guān)lutella xylostella的殺蟲活性和生長發(fā)育的影響研究。本研究擬通過光葉鐵仔甲醇提取物、大孔吸附樹脂不同餾分對小菜蛾3齡幼蟲的活性測定，初步明確其生物活性，以期為進一步開發(fā)利用光葉鐵仔提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小菜蛾為2011年由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理生化與分子毒理學(xué)實驗室引種的敏感品系，以改良的蛭石蘿卜苗法累代飼養(yǎng)至今，飼養(yǎng)條件為溫度(25±1) ℃，相對濕度60%～70%，光周期為14 h光∶10 h暗，以3齡蛻皮后12 h幼蟲為試蟲。

光葉鐵仔根、莖和葉于2011年9—11月采自重慶南川市金佛山國家自然風(fēng)景保護區(qū)，由重慶市藥用植物栽培研究所易思榮副研究員采集和鑒定。

丙酮、甲醇等試劑均為AR級。

1.2 方法

1.2.1 活性物質(zhì)的提取 分部采集光葉鐵仔根、莖和葉部材料，經(jīng)干燥、粉碎分別得到60目粉末8.3、10.0和7.5 kg。采用冷浸法[11]，加入5倍體積的甲醇進行浸提，每次持續(xù)72 h以上，期間數(shù)次搖動，浸提3次，將提取液合并、濃縮，分別得到根、莖和葉部的甲醇提取物1 328、1 680和1 250 g。以D101大孔吸附樹脂為載體，采用水及φ為30%、50%、70%和95%的乙醇對所得葉部和根莖甲醇提取物(根據(jù)成分初步判斷，絕大多數(shù)成分相似，進行合并)進行洗脫，得到根莖部水層提取物15.03 g，根莖部φ為30%、50%、70%、95%的乙醇提取物分別為10.31、14.25、13.99和18.71 g；葉部水層提取物19.24 g、葉部φ為30%、50%、70%、95%的乙醇提取物分別為12.55、11.26、13.45和14.78 g。

1.2.2 活性物質(zhì)對小菜蛾生長發(fā)育的影響 葉片載毒法[14]測定活性提取物對小菜蛾3齡幼蟲生長發(fā)育的影響。稱取光葉鐵仔根、莖、葉甲醇提取物各0.1 g，用1 mL的丙酮溶解，用蒸餾水定容到20 mL，分別配成質(zhì)量濃度為5 mg·mL–1的供試溶液；以丙酮溶液為空白對照，將新鮮甘藍Brassica oleracea葉剪成直徑2 cm的葉碟，浸入供試溶液中10 s后取出，晾干后放入濾紙保濕的塑料培養(yǎng)皿(9 cm× 9 cm)中，每皿放入4片處理葉碟，同時接入10頭饑餓處理6 h的3齡幼蟲，每個處理3次重復(fù)(在接入蟲體之前稱取每皿幼蟲的總質(zhì)量)，并在培養(yǎng)皿上覆蓋一層用細(xì)針扎過適量小孔的保鮮膜，在(25±1)℃養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)，每隔24 h更換用藥葉碟。12、24、36、48、72 h后分別檢查記錄幼蟲死亡情況，同時計算24和48 h的體質(zhì)量抑制率。

1.2.3 活性物質(zhì)對小菜蛾的拒食活性 根據(jù)文獻[14]的方法測定甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的非選擇性拒食活性和選擇性拒食活性。每一培養(yǎng)皿中放入2片處理葉碟和2片對照葉碟，交替放置，分別于24、48 h后用坐標(biāo)方格紙測定剩余面積，并計算試蟲拒食率：

式中，S對照、S處理分別表示對照和處理的取食面積。1.2.4 高餾分提取物對小菜蛾的生物活性 檢測光葉鐵仔葉部、根莖部分甲醇提取物經(jīng)D101型大孔吸附樹脂提取所得的水層餾分、30%(φ)乙醇餾分、50%(φ)乙醇餾分、70%(φ)乙醇餾分、95%(φ)乙醇餾分對小菜蛾的生物活性影響。參照1.2.2的方法，處理12、24、36、48、60、72 h后，記錄各處理小菜蛾的死亡情況，同時記錄24、48、72 h蟲體質(zhì)量及葉碟取食面積，計算校正死亡率、體質(zhì)量抑制率和非選擇拒食率，綜合考慮各種結(jié)果，篩選出生物活性較高的1～2種餾分。

1.2.5 高餾分提取物對小菜蛾生長發(fā)育的影響 參照1.2.2的方法。準(zhǔn)確稱取生物活性較高的餾分各0.4 g，用1 mL丙酮溶解，再用w為0.1%的Triton X–100溶液定容到100 mL，分別配制出質(zhì)量濃度為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg·mL–1的溶液；同時以φ為1%的丙酮溶液為空白對照。將新鮮洗凈后的甘藍葉剪成3 cm×3 cm的正方形，浸入供試液中10 s后取出，晾干后放入濾紙保濕的一次性塑料培養(yǎng)皿(9 cm×9 cm)中，每皿放1片處理葉碟，同時接入15頭饑餓處理6 h的3齡幼蟲，每個處理 2 次重復(fù)(在接入蟲體之前準(zhǔn)確稱量每皿幼蟲的總體質(zhì)量)，每隔24 h更換葉碟，前72 h飼養(yǎng)用藥葉碟，之后用新鮮葉碟飼喂。72 h前每隔12 h檢查記錄小菜蛾的死亡及發(fā)育情況，計算死亡率、校正死亡率、化蛹率和羽化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的殺蟲活性

表1為光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒作用結(jié)果，表2為光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲生長發(fā)育的影響，從表1可以看出，光葉鐵仔根、莖、葉甲醇提取物(5 mg·mL–1)對小菜蛾表現(xiàn)出一定的胃毒作用，其中以莖部甲醇提取物活性最強，且在72 h時顯著高于葉部提取物活性(P＜0.05)。從表2可以看出，根部甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲24 h的體質(zhì)量抑制率最大，達到34.77%，而在48 h后，所有處理的體質(zhì)量抑制率均下降，但莖部甲醇提取物的體質(zhì)量抑制率仍顯著高于葉部甲醇提取物體質(zhì)量抑制率(P＜0.05)。

表1 光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒作用1)Tab. 1 Stomach toxicity of methanol extracts against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

表2 光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的體質(zhì)量抑制率Tab. 2 Body weight inhibition of methanol extracts against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.2 光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性

表3為光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性，從表3可以看出，光葉鐵仔莖、根、葉部的甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲均表現(xiàn)出一定的拒食活性。在24 h時，莖部甲醇提取物的非選擇性拒食率與選擇性拒食率均最高，顯著高于葉部甲醇提取物的拒食活性(P＜0.05)；在48 h時，各處理非選擇性拒食作用進一步提高，但選擇性拒食作用則略有下降，莖甲醇提取物的拒食活性顯著高于葉部甲醇提取物拒食活性(P＜0.05)。綜合上述結(jié)果，非選擇拒食與選擇性拒食效果表現(xiàn)為莖＞根＞葉。

表3 光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性1)Tab. 3 Antifeedant effects of methanol extracts against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.3 D101型大孔吸附樹脂不同餾分對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒和拒食作用

表4結(jié)果表明，不同餾分對小菜蛾3齡幼蟲都具有一定的胃毒作用，處理后72 h時，以葉50%(φ)乙醇餾分的效果最佳，試蟲的校正死亡率達到57.50%，根莖95%(φ)和70%(φ)乙醇餾分及葉70%(φ)乙醇餾分處理的校正死亡率均高于相應(yīng)的30%乙醇餾分，但差異不顯著，且與其他餾分差異不顯著(P＞0.05)。

表4結(jié)果表明不同餾分對小菜蛾3齡幼蟲都具有一定的拒食作用，以葉50%(φ)、70%(φ)乙醇餾分及根莖95%(φ)、70%(φ)乙醇餾分對3齡小菜蛾拒食作用明顯，在24、48、72 h都達到90%以上，與其他部分餾分的差異顯著(P＜0.05)。

表4 大孔樹脂不同餾分對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒和拒食作用Tab. 4 Stomach toxicity and antifeedant effect of different fractions through macroporus resin against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.4 D101型大孔吸附樹脂不同餾分對小菜蛾3齡幼蟲生長的影響

從表5可以看出，葉50%(φ)、70%(φ)乙醇餾分以及根莖95%(φ)和70%(φ)乙醇餾分對小菜蛾3齡幼蟲體質(zhì)量抑制作用明顯，葉50%(φ)與70%(φ)乙醇餾分的體質(zhì)量抑制率在24、48、72 h時都超過了100%，結(jié)合相應(yīng)的非選擇性拒食率情況，用這些餾分處理幼蟲后，幼蟲基本沒有進食，且隨著時間的推移，部分幼蟲死亡；處理后的幼蟲與對照相比，其體長明顯較短。綜合考慮活性及試驗材料的數(shù)量，選擇根莖部95%(φ)乙醇餾分和葉部50%(φ)乙醇餾分進行后續(xù)研究。

表5 大孔樹脂不同餾分對小菜蛾3齡幼蟲體質(zhì)量的抑制作用1)Tab. 5 weight inhibition effect of different fractions through macroporus resin against the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.5 葉部50%(φ)乙醇餾分與根莖95%(φ)乙醇餾分對小菜蛾3齡幼蟲的生物活性

從表6可以看出，葉部50%(φ)乙醇餾分與根、莖95%(φ)乙醇餾分隨著質(zhì)量濃度的下降，其胃毒作用逐漸降低，在72 h時，葉部50%(φ)乙醇餾分20和 10 mg·mL–1校正死亡率最高，且與其他處理差異顯著(P＜0.05)。葉部50%(φ)乙醇餾分20 mg·mL–1處理小菜蛾3齡幼蟲后，化蛹率和羽化率最低，均僅有4.44%，且與CK差異極顯著(P＜0.01)。

表6 根莖部95%(φ)乙醇餾分與葉部50%(φ)乙醇餾分對小菜蛾 3 齡幼蟲的生物活性1)Tab. 6 The effects of 95% ethanol fraction of root and stem extract, and 50% ethanol fractions of leaf extract on bioactivities of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

3 討論與結(jié)論

近年來，有大量關(guān)于植物提取物作用于害蟲的研究與報道，從植物中尋找新的殺蟲活性物質(zhì)是開發(fā)新型殺蟲劑，克服或延緩害蟲抗藥性的有效途徑之一[14]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)商品化開發(fā)的殺蟲植物包括除蟲菊Pyrethrum cinerariifolium、魚藤 Derris trifoliata、印楝 Azadirachta indica等[13]。本研究表明，光葉鐵仔甲醇粗提取物對小菜蛾3齡幼蟲表現(xiàn)出一定的胃毒作用、拒食作用和體質(zhì)量抑制作用，部分處理存活率僅有60%，且體色發(fā)黑，與對照組的幼蟲相比極其不正常，體質(zhì)量抑制率超過100%，與陳培等[15]研究雷公藤 Tripterygium wilfordii 不定根提取物處理小菜蛾結(jié)果一致。Bandeira等[16]研究發(fā)現(xiàn)文定果Muntingia calabura花和果正己烷提取物對小菜蛾1齡幼蟲毒力最強，其LC50值分別為0.61和1.63 μg·mL–1。果實提取物對化蛹影響最大，且果和花提取物均可延長幼蟲發(fā)育歷期2 d左右。光葉鐵仔根莖95%(φ)乙醇餾分20 mg·mL–1對小菜蛾的胃毒作用雖不明顯，但對其化蛹率、羽化率等都有一定的影響，葉50%(φ)乙醇餾分的胃毒作用比根莖95%(φ)乙醇餾分更高且差異顯著，且抑制化蛹或羽化，小菜蛾出現(xiàn)畸形蛹，或后期部分蛹即使羽化，其成蟲也出現(xiàn)畸形，導(dǎo)致羽化率降低。光葉鐵仔提取物處理小菜蛾幼蟲與近年來部分植物提取物表現(xiàn)出相似的效果[17]，胃毒作用不強，但拒食效果與體質(zhì)量抑制效果較好，影響小菜蛾的化蛹與羽化。

本試驗采用葉片載毒法，通過活性跟蹤分離技術(shù)初步明確了光葉鐵仔不同部位甲醇提取物、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇大孔吸附樹脂餾分對小菜蛾3齡幼蟲的生物活性，初步明確了光葉鐵仔甲醇提取物對小菜蛾3齡幼蟲的非選擇與選擇性拒食活性、體質(zhì)量抑制活性，以及對小菜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響，對光葉鐵仔作為植物源農(nóng)藥的后續(xù)研究與開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

Effects of Myrsine stolonifera extracts on growth and development of Plutella xylostella larvae

WANG Xuegui, YU Ting, LI Qian
(College of Agriculture, Sichuan Agricultural University/Biorational Pesticide Research Lab, Chengdu 611130, China)

【Objective】To study the effects of Myrsine stolonifera extracts on growth and development of Plutella xylostella larvae.【Method】The bioactivities of M. stolonifera root, stem and leaf methanol extracts, and ethanol fractions of methanol extracts through macroporous resin against P. xylostella were determined by disc leaf method. The effects of ethanol fractions of extracts through macroporous resin on P. xylostella growth and development were studied.【Result】The root，stem and leaf methanol extracts of M. stolonifera and ethanol fractions of extracts through macroporous resin displayed stomach toxicity against P. xylostella. The 50% ethanol fraction of leaf extracts had the strongest insecticidal activity with an adjusted mortality of 75.56% after 72 h. The 95% ethanol fractions of root and stem extracts and 50% ethanol fractions of leaf extracts showed strong antifeedant activities and growth inhibition effects against P. xylostella larvae, with the antifeedant rates and growth inhibition rates over 90%. The extracts affected pupation and eclosion of P. xylostella.【Conclusion】M. stolonifera extracts display strong insecticidal activities against P. xylostella larvae. The insecticidal ingredients and mechanisms should be further studied.

Myrsine stolonifera; extract; Plutella xylostella; macroporous resin; growth and development; antifeedant activity

S436.3

A

1001-411X(2017)05-0061-06

王學(xué)貴, 余婷, 李倩. 光葉鐵仔提取物對小菜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2017, 38(5): 61-66.

2016-12-31 優(yōu)先出版時間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0859.022.html

王學(xué)貴(1976—)，男，副教授，博士，E-mail: wangxuegui@sicau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(31101493)