許秀玉， 張衛(wèi)強(qiáng)， 黃鈺輝， 甘先華， 仲崇祿， 張華新

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 國(guó)家林業(yè)局鹽堿地研究中心， 北京 100091； 2 廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520； 3 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

木麻黃青枯病抗性鑒定方法比較及抗病種質(zhì)篩選

許秀玉1,2， 張衛(wèi)強(qiáng)2， 黃鈺輝2， 甘先華2， 仲崇祿3， 張華新1

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 國(guó)家林業(yè)局鹽堿地研究中心， 北京 100091； 2 廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520； 3 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

【目的】篩選出簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠的木麻黃(Casuarinaceae)青枯病抗性鑒定方法，對(duì)我國(guó)現(xiàn)有的木麻黃種質(zhì)資源開(kāi)展抗病性鑒定與評(píng)價(jià)，篩選出優(yōu)良抗病無(wú)性系?！痉椒ā吭谀韭辄S抗病品系篩選技術(shù)基礎(chǔ)上，參考番茄Lycopersiconesculentum、煙草Nicotiana及桉樹(shù)Eucalyptus等植物青枯病抗性鑒定方法，設(shè)計(jì)8種木麻黃青枯菌人工接種方法，系統(tǒng)探討水培生根苗、嫩枝、綠梗小枝、褐梗小枝、青枯菌粗毒素及盆栽小苗傷根接種、盆栽小苗無(wú)傷接種等接種方法對(duì)木麻黃青枯病抗性鑒定的影響?！窘Y(jié)果】不同無(wú)性系利用盆栽幼苗傷根接種法接種后的死亡率介于25.79%～83.06%，無(wú)性系K18、A14與G1、30差異極顯著(P<0.05)；不同無(wú)性系用褐梗小枝室內(nèi)水培接種的病情指數(shù)介于2.16～69.48，無(wú)性系K18、A14與G1、30差異極顯著(P<0.05)。這2種接種方法能夠有效區(qū)分木麻黃抗、感無(wú)性系，且呈極顯著正相關(guān)(r=0.856 5)。不同無(wú)性系在盆栽幼苗不傷根接種及水培生根小苗、嫩枝室內(nèi)水培接種中抗病性差異不顯著(P>0.05)，不能有效區(qū)分抗、感無(wú)性系。綠梗小枝接種后癥狀變化小，不易分級(jí)，容易出現(xiàn)觀測(cè)誤差；青枯菌粗毒素接種存在濃度難以控制等問(wèn)題。利用褐梗小枝室內(nèi)水培接種法，對(duì)53份木麻黃育種材料進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，篩選出X1、30、雜交、G1等12份高抗材料。【結(jié)論】盆栽幼苗傷根接種及褐梗小枝室內(nèi)水培接種方法是木麻黃青枯病抗性鑒定的較好方法，文中其他接種方法不是木麻黃青枯病抗性鑒定的優(yōu)選方法。

木麻黃； 青枯病； 抗病性； 鑒定方法； 種質(zhì)資源

植物細(xì)菌性青枯病為青枯勞爾氏菌Ralstoniasolanacearum引起的毀滅性土傳病害，是世界范圍內(nèi)傳播廣泛、危害嚴(yán)重、最難防治的細(xì)菌性重大病害之一[1]，可危害54科的450余種植物[2]。木麻黃科Casuarinaceae植物原產(chǎn)澳大利亞和太平洋島嶼，包括4屬96種，木麻黃是該科植物的統(tǒng)稱。由于具有抗風(fēng)、抗旱、耐鹽堿、速生的特點(diǎn)，木麻黃被廣泛用于防風(fēng)固沙、鹽堿地改良和干旱區(qū)造林，已成為廣東省沿海防護(hù)林主栽樹(shù)種。長(zhǎng)期以來(lái)，隨著少量無(wú)性系大面積造林，使得木麻黃防護(hù)林帶退化，遺傳多樣性降低，林木生長(zhǎng)衰退，木麻黃青枯病迅速擴(kuò)展蔓延。近幾年廣東省大面積伐除感病沿海防護(hù)林帶，但卻沒(méi)有其他樹(shù)種可替代種植，嚴(yán)重影響該地區(qū)生態(tài)安全與國(guó)土安全。木麻黃青枯病的防治目前仍是一大難題，對(duì)已有木麻黃種質(zhì)資源進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)并選育出抗病無(wú)性系是最經(jīng)濟(jì)有效的途徑?？共⌒澡b定是抗病育種的基礎(chǔ)，而抗性鑒定方法又是此項(xiàng)工作的關(guān)鍵。

國(guó)內(nèi)外對(duì)木麻黃青枯病的研究較少，相關(guān)研究工作主要集中在20世紀(jì)末，如接種方法及接種條件的研究[3-4]、木麻黃不同樹(shù)種或種源的青枯病抗病能力評(píng)價(jià)[5-7]和抗病優(yōu)良品系的篩選[3,8-10]等，選育出了A8、A13、501等一些抗病無(wú)性系。但由于青枯菌能與植物、環(huán)境相互作用，協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)生變異[11]，原來(lái)選育出的抗病無(wú)性系隨著時(shí)間推移其抗病性大大降低。本研究在郭權(quán)等[3]、王軍[4]、梁子超等[12]及陳炳銓等[13]木麻黃抗病品系篩選技術(shù)基礎(chǔ)上，參考番茄Lycopersiconesculentum、煙草Nicotiana、廣藿香Pogostemoncablin及桉樹(shù)Eucalyptus等植物青枯病抗性鑒定方法[14-18]，設(shè)計(jì)了8種木麻黃青枯菌人工接種方法，系統(tǒng)探討和評(píng)價(jià)不同接種方法對(duì)木麻黃青枯病抗性鑒定的影響，篩選出盆栽幼苗傷根接種及褐梗小枝室內(nèi)接種等準(zhǔn)確、可靠的抗性鑒定方法，并對(duì)我國(guó)現(xiàn)有的木麻黃種質(zhì)資源開(kāi)展青枯病抗病性鑒定，選育出優(yōu)良抗病無(wú)性系。這為現(xiàn)有防護(hù)林體系的樹(shù)種替換提供了有潛力的種植材料，對(duì)有效控制我國(guó)木麻黃青枯病、提高木麻黃防護(hù)林的質(zhì)量及促進(jìn)木麻黃抗病育種均有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用廣東省林業(yè)科學(xué)研究院分離鑒定出的木麻黃強(qiáng)致病性青枯菌株Rs-M、Rs-GL-2和Rs-H為供試菌株。選擇抗性不同的木麻黃無(wú)性系A(chǔ)14、K18、G1及30作為抗性鑒定方法研究的試驗(yàn)材料，對(duì)廣東、福建、海南根據(jù)不同的育種目的選育出來(lái)的53個(gè)木麻黃優(yōu)良無(wú)性系進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。試驗(yàn)苗木由廣東省林業(yè)科學(xué)院中心苗圃提供。

1.2 菌液的制備

參考劉勇等[14]方法，供試菌株在TTC培養(yǎng)基(2,2,3-三苯基四唑氯瓊脂培養(yǎng)基)上活化培養(yǎng)48 h后，挑選單菌落接種到CPG液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g·L-1，水解酪蛋白1 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1)中，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)28～36 h。培養(yǎng)液于5 000 r·min-1離心15 min，收集菌體，用無(wú)菌水配制成 3×108cfu·mL-1(平板計(jì)數(shù)法)菌懸液用于室內(nèi)水培接種，配制成2.7×109cfu·mL-1(平板計(jì)數(shù)法)菌懸液用于盆栽接種。

1.3 抗性鑒定方法

1.3.1 盆栽接種及病情調(diào)查 設(shè)計(jì)2種盆栽接種方法。幼苗傷根接種(M1)：參考移栽浸根法[15]，除去袋苗外層的塑料袋，抖落土壤，洗凈根部，除去基部黃化葉片，剪去1/3根系，再浸入配制好的細(xì)菌懸浮液中，30～31 ℃條件下保濕浸根培養(yǎng)30 min，然后種植于裝有草木灰與黃心土(體積比為1∶2)的塑料盆中。 幼苗不傷根接種(M2)：于試驗(yàn)前1個(gè)月將試驗(yàn)小苗移栽到裝有草木灰與黃心土(體積比為1∶2)的塑料盆中，移栽1個(gè)月待小苗完全恢復(fù)生長(zhǎng)后進(jìn)行淋根接種試驗(yàn)。

接種試驗(yàn)按隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)無(wú)性系種3盆，每盆種20～25株，以無(wú)菌水作陰性對(duì)照。接種后每天澆水保持盆內(nèi)濕潤(rùn)，晝夜溫度為30～35 ℃，相對(duì)濕度80%左右，每天觀察記錄植株發(fā)病情況，接菌后10 d進(jìn)行病情調(diào)查。調(diào)查時(shí)以盆為單位進(jìn)行，記錄無(wú)病植株數(shù)與死亡植株數(shù)，計(jì)算死亡率:

死亡率=死亡植株數(shù)/總株數(shù)×100%。

1.3.2 室內(nèi)水培接種及病情調(diào)查 采用恒溫水培法[4],將試驗(yàn)材料浸入盛有200 mL青枯菌懸浮液的玻璃瓶?jī)?nèi)，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，相對(duì)濕度85%，光照時(shí)間13 h，光照強(qiáng)度為8 000 lx。設(shè)計(jì)4種不同類(lèi)型接種材料：水培生根小苗接種(M3)，即剛萌發(fā)出新根的幼嫩小苗接種，輕微損傷根尖；嫩枝接種(M4)，即無(wú)分枝，高8～15 cm，基徑1 mm左右的非木質(zhì)化綠色幼嫩小枝接種；綠梗小枝接種(M5)，即多分枝，基徑2～3 mm的綠色半木質(zhì)化小枝接種；褐梗小枝接種(M6)：即多分枝，基徑2～5 mm的褐色木質(zhì)化小枝接種。

接種試驗(yàn)按隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)無(wú)性系接種3瓶，無(wú)菌水作對(duì)照。嫩枝及水培生根苗接種試驗(yàn)時(shí)，每瓶裝20～25條7～10 cm長(zhǎng)嫩枝或生根小苗。綠梗及褐梗小枝接種試驗(yàn)時(shí)，將生長(zhǎng)一致的綠梗及褐梗小枝剪成長(zhǎng)15～20 cm的莖段，每個(gè)莖段含有8～10個(gè)分枝，每瓶裝3～4個(gè)莖段。每天觀察記錄植株發(fā)病情況，用第5天數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

室內(nèi)水培接種試驗(yàn)抗性水平的劃分方法參考相對(duì)病害強(qiáng)度(RDI)[4]及Yamazaki[19]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將侵染后的木麻黃小枝病情分為4個(gè)等級(jí)：0級(jí)，分枝無(wú)癥狀；1級(jí)，分枝萎蔫下垂，保持綠色；2級(jí)，分枝枯黃、萎蔫下垂；3級(jí)，小枝干枯死亡。計(jì)算病情指數(shù)(I):

1.3.3 青枯菌粗毒素接種及病情調(diào)查 采用過(guò)濾滅菌法及高溫高壓滅菌法制備青枯菌粗毒素[16,20]。過(guò)濾滅菌法(M7)：供試菌株在CPG液體培養(yǎng)基中、30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)28～36 h后，在5 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液，經(jīng)孔徑0.22 μm的細(xì)菌過(guò)濾膜抽真空過(guò)濾。高溫高壓滅菌法(M8)：供試菌株在CPG液體培養(yǎng)基中30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)28～36 h后，在121 ℃條件下高壓滅菌25 min。

將得到的青枯菌粗毒素稀釋5倍，用于室內(nèi)水培接種木麻黃褐化小枝，設(shè)計(jì)4個(gè)無(wú)性系，每個(gè)無(wú)性系3次重復(fù)，無(wú)菌水作對(duì)照，病害強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及病情調(diào)查同1.3.2室內(nèi)水培接種。

1.4 木麻黃種質(zhì)資源抗性評(píng)價(jià)

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，利用木麻黃最佳人工接種鑒定方法，設(shè)計(jì)3個(gè)菌株、53個(gè)無(wú)性系、3～5次重復(fù)的雙因素交叉試驗(yàn)，以A13無(wú)性系接種無(wú)菌水為對(duì)照(CK)，對(duì)我國(guó)現(xiàn)有木麻黃種質(zhì)資源開(kāi)展青枯病的抗性鑒定與評(píng)價(jià)，將53份參試材料分為高感(HS，病情指數(shù)70以上)、中感(MS，病情指數(shù)50～70)、中抗(MR，病情指數(shù)30～50)及高抗(HR，病情指數(shù)30以下)4個(gè)等級(jí)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，采用SAS V8.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析及Duncan’s多重比較檢驗(yàn)不同平均值間的差異等。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性鑒定方法的比較

2.1.1 不同方法的抗性鑒定結(jié)果 由表1可以看出，幼苗不傷根情況下進(jìn)行盆栽接種引起的苗木死亡率較低(小于10%)，不能很好地區(qū)分出4個(gè)供試的抗、感無(wú)性系，G1無(wú)性系中未發(fā)現(xiàn)死亡幼苗。幼苗傷根后進(jìn)行盆栽接種可以很好地鑒定出4個(gè)供試無(wú)性系的抗性強(qiáng)弱，無(wú)性系K18、A14與G1、30死亡率差異極顯著，接種10 d后木麻黃K18、A14無(wú)性系死亡率在80%以上，表現(xiàn)為感??；無(wú)性系G1、30死亡率分別為25.79%、33.77%，表現(xiàn)為抗病。

室內(nèi)水培接種試驗(yàn)表明：以水培生根小苗及嫩枝進(jìn)行人工接種，5 d后所有小枝或分枝均保持綠色，幾乎不萎蔫，病情指數(shù)低于1，各無(wú)性系間無(wú)顯著差異，不能區(qū)分出4個(gè)供試的抗感病無(wú)性系；以綠梗小枝進(jìn)行人工接種，雖然無(wú)性系K18、A14與G1、30間病情指數(shù)差異顯著，K18、A14表現(xiàn)為感病，G1、30表現(xiàn)為抗病，但病情指數(shù)較小(16.58～27.36)，綠梗小枝上的分枝只表現(xiàn)出綠色萎蔫下垂及枯黃萎蔫下垂，極少出現(xiàn)干枯死亡的癥狀，不能明顯反映材料的抗感病特性；以褐梗小枝進(jìn)行人工接種，病情指數(shù)在無(wú)性系K18、A14與G1、30間差異極顯著，K18、A14病情指數(shù)分別為69.48、51.87，表現(xiàn)為感病，G1、30病情指數(shù)為2.41、2.16，表現(xiàn)為抗病，隨著發(fā)病進(jìn)程，褐梗小枝上的分枝先后表現(xiàn)出綠色萎蔫下垂、枯黃萎蔫下垂及干枯3種不同形態(tài)。

青枯菌粗毒素接種試驗(yàn)表明，無(wú)論是用高溫高壓滅菌法還是過(guò)濾滅菌法獲得的粗毒素都能讓木麻黃褐梗小枝迅速表現(xiàn)青枯病典型癥狀，無(wú)性系K18、A14與G1、30間病情指數(shù)差異極顯著，A14及K18感病無(wú)性系的病情指數(shù)達(dá)40以上，G1及30抗病無(wú)性系病情指數(shù)均低于10，從數(shù)據(jù)上看，青枯菌粗毒素2種制備方法對(duì)褐梗小枝的致病性無(wú)顯著差異。

表1 木麻黃抗、感無(wú)性系在不同抗性鑒定方法下的鑒定結(jié)果1)

Tab.1 Resistance identification results for Casuarinaceae clones with various resistance degrees using different inoculation methods

無(wú)性系室外盆栽接種的死亡率/%室內(nèi)水培接種的病情指數(shù)青枯菌粗毒素接種的病情指數(shù)M1M2M3M4M5M6M7M8A1481.29±13.55a4.01±3.04a0.89±0.22a0.96±0.13a26.69±7.88a51.87±26.27a53.76±8.67a40.28±11.6aK1883.06±16.86a5.70±3.10a0.81±0.34a0.89±0.22a27.36±12.55a69.48±14.55a60.50±23.53a59.48±14.55aG125.79±14.02b0.00±0.00b0.86±0.13a0.92±0.22a20.83±3.11b2.41±1.07b1.89±0.77b3.83±1.43b3033.77±12.32b6.57±4.51a0.74±0.26a0.82±0.13a16.58±1.23b2.16±2.02b1.33±1.34b4.05±2.73b

1)同列數(shù)據(jù)后凡是具有一個(gè)相同小寫(xiě)字母者，表示在0.05水平差異不顯著(Duncan’s法)。M1：盆栽幼苗傷根接種；M2：盆栽幼苗不傷根接種；M3：水培生根小苗室內(nèi)水培接種；M4：嫩枝室內(nèi)水培接種；M5：綠梗小枝室內(nèi)水培接種；M6：褐梗小枝室內(nèi)水培接種；M7：高溫高壓滅菌法制備青枯菌粗毒素室內(nèi)水培接種；M8：過(guò)濾滅菌法制備青枯菌粗毒素室內(nèi)水培接種。

2.1.2 不同鑒定方法的相關(guān)性 相關(guān)分析表明(表2)，不同鑒定方法之間既有正相關(guān)，也有負(fù)相關(guān)。盆栽幼苗不傷根接種、水培生根小苗室內(nèi)水培接種及嫩枝室內(nèi)水培接種與其他鑒定方法均相關(guān)性不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明這幾種鑒定方法對(duì)木麻黃無(wú)性系抗性鑒定的參考意義不大。

盆栽幼苗傷根接種、綠梗小枝室內(nèi)水培、褐梗小枝室內(nèi)水培及青枯菌粗毒素接種等5種鑒定方法之間呈極顯著正相關(guān)，除綠梗小枝室內(nèi)接種方法外，其他4種鑒定方法間相關(guān)系數(shù)均大于0.800 0，其中盆栽幼苗傷根接種與褐梗小枝室內(nèi)水培鑒定法相關(guān)系數(shù)達(dá)0.856 5，褐梗小枝室內(nèi)水培鑒定法與高溫高壓滅菌法制備青枯菌粗毒素接種鑒定法相關(guān)系數(shù)為0.889 8，結(jié)合表1抗性鑒定結(jié)果表明，這幾種鑒定方法對(duì)木麻黃青枯病抗性鑒定較為有效。

表2 不同抗性鑒定方法的相關(guān)分析1)Tab.2 Correlation analysis among different identification methods

1)**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示顯著相關(guān)(P<0.05)；M1：盆栽幼苗傷根接種；M2：盆栽幼苗不傷根接種；M3：水培生根小苗室內(nèi)水培接種；M4：嫩枝室內(nèi)水培接種；M5：綠梗小枝室內(nèi)水培接種；M6：褐梗小枝室內(nèi)水培接種；M7：高溫高壓滅菌法制備青枯菌粗毒素室內(nèi)水培接種；M8：過(guò)濾滅菌法制備青枯菌粗毒素室內(nèi)水培接種。

2.1.3 不同抗性鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn) 雖然盆栽幼苗傷根接種、綠梗小枝室內(nèi)水培接種、褐梗小枝室內(nèi)水培接種及青枯菌粗毒素接種等5種鑒定法都能有效地區(qū)分木麻黃抗、感無(wú)性系，且相關(guān)極顯著，但這些鑒定方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)(表3)。

盆栽接種鑒定法可以模擬自然狀態(tài)下青枯菌由植物根部表皮細(xì)胞、皮層細(xì)胞、中柱鞘細(xì)胞侵入植物維管束組織的過(guò)程，能夠最真實(shí)地反映植物材料的抗性水平，但是這種鑒定方法需要較多的參試材料(每處理75～100株)，且要求苗齡一致，生長(zhǎng)狀態(tài)一致。盆栽幼苗傷根接種法還需要剪根、浸泡及種植等過(guò)程，操作較復(fù)雜；盆栽幼苗不傷根鑒定法接種死亡率大大降低，難以較好地區(qū)分抗、感無(wú)性系。

室內(nèi)水培接種鑒定法簡(jiǎn)便易行，操作簡(jiǎn)單、無(wú)需大型儀器設(shè)備，所需植物材料少、發(fā)病進(jìn)程短，但要想獲得可靠的鑒定結(jié)論，避免枝條自然干枯，試驗(yàn)過(guò)程要保持環(huán)境濕度85%以上，溫度28 ℃以上。此外，室內(nèi)水培接種鑒定法對(duì)莖段的選擇要求嚴(yán)格。水培生根小苗及嫩枝對(duì)青枯菌抗性強(qiáng)，接種5 d后病情指數(shù)低于1，不能區(qū)分抗、感材料；綠梗小枝水培接種5 d后病情指數(shù)有所上升，但分枝只表現(xiàn)出萎蔫下垂及發(fā)黃的癥狀，且癥狀變化小，不易分級(jí)，容易出現(xiàn)觀測(cè)誤差，影響鑒定結(jié)果；褐梗小枝水培接種法的病程短，5 d后即可進(jìn)行觀測(cè)，分枝可明顯地分為正常、萎蔫下垂、枯黃萎蔫下垂及干枯幾個(gè)等級(jí)，能有效區(qū)分抗、感無(wú)性系。

青枯菌粗毒素接種法與褐梗小枝室內(nèi)接種法呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.88，但是利用高溫高壓滅菌法制備青枯菌粗毒素時(shí)，對(duì)粗毒素的濃度難以準(zhǔn)確控制；利用過(guò)濾滅菌法難以一次性將青枯菌完全過(guò)濾干凈，得到的粗毒素通常放置12～24 h后又長(zhǎng)出青枯菌，需要反復(fù)多次過(guò)濾并設(shè)置空白對(duì)照，因此利用青枯菌粗毒素接種不是木麻黃青枯病抗病鑒定的優(yōu)選方法。

表3 不同抗性鑒定方法的比較Tab.3 Comparison of different identification methods

1)M1：盆栽幼苗傷根接種；M2：盆栽幼苗不傷根接種；M3：水培生根小苗室內(nèi)水培接種；M4：嫩枝室內(nèi)水培接種；M5：綠梗小枝室內(nèi)水培接種；M6：褐梗小枝室內(nèi)水培接種；M7：高溫高壓滅菌法制備青枯菌粗毒素室內(nèi)水培接種；M8：過(guò)濾滅菌法制備青枯菌粗毒素室內(nèi)水培接種。

綜上所述，盆栽幼苗傷根接種及褐梗小枝室內(nèi)接種是木麻黃青枯病抗性鑒定的最佳方法，這2種方法能夠有效區(qū)分木麻黃抗、感無(wú)性系，可靠性好，鑒定結(jié)果極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.856 5。盆栽幼苗不傷根接種及水培生根小苗、嫩枝室內(nèi)接種不適宜作為木麻黃青枯病抗性鑒定方法，綠梗小枝室內(nèi)接種與青枯菌粗毒素接種也不是優(yōu)選方法。

2.2 木麻黃種質(zhì)資源抗性評(píng)價(jià)

根據(jù)上述研究成果，選用Rs-M、Rs-GL-2、Rs-H菌株，利用褐梗小枝室內(nèi)接種法對(duì)53份木麻黃育種材料進(jìn)行抗病性差異的比較。結(jié)果(表4)顯示：53個(gè)木麻黃參試無(wú)性系病情指數(shù)具有極顯著差異，菌株、無(wú)性系以及菌株與無(wú)性系的交互作用都對(duì)木麻黃植株發(fā)病程度具有極顯著的影響(P<0.01)。53個(gè)參試無(wú)性系病情指數(shù)在0 ～ 100之間(表5)，12、抗風(fēng)、83、59、65、K18及A14無(wú)性系在Rs-GL-2菌株中病情指數(shù)達(dá)100，接種5 d后幾乎所有小枝黃化、干枯死亡； X1、45、平5、W6、501及41無(wú)性系在Rs-H菌株中病情指數(shù)小于10；X1、45、30、雜交、501、G1、503無(wú)性系在Rs-M菌株中病情指數(shù)為0，無(wú)發(fā)病癥狀，生長(zhǎng)狀況良好，小枝保持濃綠色，挺立生長(zhǎng)，不萎蔫、不下垂。

表4 木麻黃無(wú)性系病情指數(shù)方差分析1)

Tab.4 Variance analysis of disease indexes for Casuarinaceae clones

變異來(lái)源自由度平方和均方F菌株2137122.46968561.234533.09**無(wú)性系52232801.1814476.94534.81**無(wú)性系×菌株10458764.009556.0384.39**誤差33242698.699128.610

1)**表示0.01水平差異極顯著(不等重復(fù)試驗(yàn)雙因素方差分析)。

表5 53個(gè)木麻黃無(wú)性系青枯病抗性鑒定結(jié)果Tab.5 Resistance identification results of 53 Casuarinaceae clones

續(xù)表5 Tab.5 continued

無(wú)性系來(lái)源病情指數(shù)Rs-MRs-GL-2Rs-H平均值1)抗性分級(jí)2)16海南50.0±0.087.5±12.084.6±16.674.7ABCHS82福建55.1±16.597.8±2.173.2±1.875.4ABCHS37福建59.3±8.092.9±4.774.7±13.375.6ABCHSG88廣東56.2±16.681.8±19.188.3±13.876.1ABCHS59福建57.7±9.4100.0±0.076.4±13.078.0ABCHS65福建57.9±8.3100.0±0.076.8±14.178.2ABCHSA14廣東50.0±0.0100.0±0.076.0±15.679.7ABHSK18廣東72.8±19.9100.0±0.079.2±23.082.3AHS

1)該列數(shù)據(jù)后，凡是有一個(gè)相同大寫(xiě)字母者，表示在0.01水平差異不顯著(Duncan’s法); HR:高抗，病情指數(shù)30以下；MR：中抗，病情指數(shù)30～50；MS：中感，病情指數(shù)50～70；HS：高感，病情指數(shù)70以上。

利用 Duncan’s法進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)，X1、45、平5、30、W6、雜交、501、G1無(wú)性系之間抗性無(wú)顯著差異，平均病情指數(shù)介于13.3～17.0；20、21、C7、2、16、82、37、G88、59及65無(wú)性系間無(wú)顯著差異，平均病情指數(shù)為73.7～78.2。利用平均病情指數(shù)結(jié)合多重比較將這53份參試材料分為高感(HS)、中感(MS)、中抗(MR)及高抗(HR)4個(gè)等級(jí)(表5)，篩選出X1、45、平5、30、W6、雜交、501、G1、503、41、A1及A1-3等12個(gè)高抗無(wú)性系。

3 討論與結(jié)論

建立可靠、真實(shí)反映病害程度的鑒定方法是從事木麻黃抗病育種研究的基礎(chǔ)。不同鑒定方法效果不同，試驗(yàn)表明，盆栽幼苗傷根接種及褐梗小枝室內(nèi)水培接種是木麻黃青枯病抗性鑒定的最佳方法，能夠有效區(qū)分木麻黃抗、感無(wú)性系，準(zhǔn)確可靠，鑒定結(jié)果極顯著正相關(guān)。這2種方法各有優(yōu)勢(shì)，可視參試材料、試驗(yàn)條件選擇。

研究發(fā)現(xiàn)病菌侵入植物后在根內(nèi)組織迅速增殖和擴(kuò)展是其產(chǎn)生較強(qiáng)致病性的重要原因[21]，雖然不傷根接種法是馬鈴薯Solanumtuberosum[22]及廣藿香[23]等植物青枯病抗性鑒定的有效方法，但木麻黃盆栽幼苗不傷根接種死亡率大大降低，且抗、感無(wú)性系差異不顯著，這表明木麻黃根系對(duì)于青枯菌的入侵是一自然屏障，能夠阻止病菌自由進(jìn)入寄主體內(nèi)，具有抗侵入作用。這也部分解釋了廣東省木麻黃沿海防護(hù)林青枯病大爆發(fā)通常發(fā)生在臺(tái)風(fēng)過(guò)后這種現(xiàn)象。臺(tái)風(fēng)引起的林木根系松動(dòng)、斷裂及損傷等都有利于青枯菌從根部侵入。

室內(nèi)接種試驗(yàn)時(shí)，木麻黃接種材料越幼態(tài)其抗性越好，這可能與幼態(tài)材料含有更高生理活化酶有關(guān)[4]。水培生根小苗接種5 d后幾乎不萎蔫，抗、感無(wú)性系間無(wú)顯著性差異，與褐梗小枝鑒定結(jié)果相關(guān)性不顯著，不宜作為木麻黃室內(nèi)水培接種試驗(yàn)材料，此結(jié)論與王軍[4]無(wú)根苗與水培出根后的幼苗室內(nèi)接種發(fā)病趨勢(shì)一致的結(jié)論相左。王軍[4]研究認(rèn)為綠梗小枝也適用于木麻黃青枯病抗性鑒定，但筆者認(rèn)為綠梗小枝病害癥狀變化小，不易分級(jí)，容易出現(xiàn)觀測(cè)誤差，不是優(yōu)選方法。

甘薯Dioscoreaesculenta[24]、廣藿香[16]、花生Arachishypogaea[25]等植物均可利用青枯菌粗毒素進(jìn)行抗病性鑒定，本研究中青枯菌粗毒素對(duì)木麻黃褐化小枝具有致病性，且高溫高壓對(duì)粗毒素生物活性沒(méi)有影響，此結(jié)論與王軍等[20]研究結(jié)果相類(lèi)似，與張燕玲等[16]、種藏文等[24]認(rèn)為高溫會(huì)使粗毒素毒力大大降低的結(jié)論不同。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)孔徑0.22 μm的細(xì)菌過(guò)濾膜抽真空過(guò)濾制備粗毒素的效果不好，得到的粗毒素通常放置12～24 h后又長(zhǎng)出青枯菌，此方法也不是木麻黃青枯病抗病鑒定的優(yōu)選方法。

本試驗(yàn)利用褐梗小枝室內(nèi)水培接種法，對(duì)53份木麻黃育種材料進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，篩選出X1、45、平5、30、W6、雜交、501、G1、503、41、A1及A1-3等12份高抗材料，這不僅可為現(xiàn)有防護(hù)林體系提供抗病種植材料，也為今后的木麻黃雜交育種、抗性分子標(biāo)記等研究奠定基礎(chǔ)。經(jīng)鑒定，早期選育出的木麻黃抗病無(wú)性系A(chǔ)14、A13及A8抗性明顯降低，這與桉樹(shù)抗病性存在衰退的結(jié)論相一致[26]，這一方面可能與無(wú)性系退化有關(guān)，另一方面可能與青枯菌具有與植物、環(huán)境協(xié)同進(jìn)化，發(fā)生變異有關(guān)。

木麻黃青枯病是一種嚴(yán)重病害，但是目前相關(guān)研究不多，建立起一套快速、可靠、高效的檢測(cè)方法還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。此外，抗源的篩選結(jié)果也難以令人滿意，雖然抗病性廣泛存在，但還未發(fā)現(xiàn)免疫類(lèi)型，所以更全面篩選、尋找、創(chuàng)造抗源材料是今后的一個(gè)研究方向。

[1] SALANOUBAT M, GENIN S, ARTIGUENAVE F, et al. Genome sequence of the plant pathogenRalstoniasolanacearum[J]. Nature, 2002, 415(6871): 497-502.

[2] 喬俊卿, 陳志誼, 劉郵洲, 等. 茄科作物青枯病研究進(jìn)展[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2013, 43 (1): 1-10.

[3] 郭權(quán), 梁子超. 木麻黃抗青枯病品系的篩選技術(shù)和綜合防治措施[J]. 林業(yè)科技通訊, 1986(4): 7-9.

[4] 王軍. 影響木麻黃青枯病抗性測(cè)定的幾項(xiàng)因素研究[J]. 林業(yè)科學(xué), 1996, 32(3): 225-229.

[5] 何學(xué)友. 木麻黃病害研究概述[J]. 防護(hù)林科技, 2007(2): 27-30.

[6] 黃金水, 何益良, 鄭輝棋. 幾種木麻黃抗病蟲(chóng)性調(diào)查報(bào)告[J]. 福建林業(yè)科技, 1985, 12(2): 41-45.

[7] 魏素梅, 譚天泳. 木麻黃地理種源的苗期試驗(yàn)[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 1990, 3(2): 119-126.

[8] 梁子超, 陳小華. 木麻黃抗青枯病品系的篩選[J]. 華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1984, 5(1): 53-59.

[9] 彭國(guó)強(qiáng). 木麻黃抗青枯病無(wú)性系造林對(duì)比試驗(yàn)[J]. 廣東林業(yè)科技, 2000, 16(3): 35-37.

[10]柯玉鑄, 黃金水, 林延生, 等. 普通木麻黃抗逆無(wú)性系的篩選[J]. 福建林業(yè)科技, 1994, 21(1): 39-43.

[11]苗立祥. 番茄抗青枯病的AFLP分子標(biāo)記及其相關(guān)基因的克隆[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2008.

[12]梁子超, 王祖太. 粗雜木麻黃對(duì)青枯病抗性的測(cè)定[J]. 熱帶林業(yè)科技, 1982(1): 31-34.

[13]陳炳銓, 張景寧. 木麻黃無(wú)性系對(duì)青枯菌抗性及菌株變異初探[J]. 廣東林業(yè)科技, 1995, 11(2): 33-36.

[14]劉勇, 秦西云, 李文正, 等. 抗青枯病煙草種質(zhì)資源在云南省的評(píng)價(jià)[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2010, 11(1): 10-16.

[15]尹賢貴, 王小佳, 張赟, 等. 我國(guó)番茄青枯病及抗病育種研究進(jìn)展[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 20(2): 163-167.

[16]張燕玲, 賀紅, 吳立蓉, 等. 廣藿香抗青枯病離體篩選技術(shù)的研究[J]. 廣西植物, 2009, 29(5): 678-682.

[17]王艷麗. 桉樹(shù)抗青枯病的鑒定及其抗病機(jī)制研究[D]. 石家莊: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[18]王勝坤. 桉樹(shù)青枯菌菌株致病力分化、吸附識(shí)別及PCR快速檢測(cè)研究[D]. 北京: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院, 2007.

[19]YAMAZAKI H. Relation between resistance to bacterial wilt and calcium nutrition in tomato seedlings[J]. Jarq-Japan Agric Res Quart, 2001, 35(3): 163-169.

[20]王軍, 蘇海, 鄧志文. 青枯假單胞桿菌對(duì)木麻黃致病機(jī)理的初步研究[J]. 森林病蟲(chóng)通訊, 1997(2): 21-22.

[21]羅煥亮, 王軍, 邵志芳, 等. 木麻黃青枯菌的根表吸附及根內(nèi)增殖與其致病性關(guān)系[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2002, 15(1): 21-27.

[22]李廣存, 金黎平, 謝開(kāi)云, 等. 馬鈴薯青枯病抗性鑒定新方法[J]. 中國(guó)馬鈴薯, 2006, 20(3): 129-134.

[23]徐燃, 賀紅, 鄧素堅(jiān), 等. 青枯菌侵染廣藿香的組織病理學(xué)研究[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 30(2): 236-239.

[24]種藏文, 盧同, 李本金, 等. 甘薯青枯菌粗毒素的制備及熱、紫外線、酶對(duì)粗毒素生物活性的影響[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1998, 13(1): 36-40.

[25]袁宗勝, 劉芳, 胡方平. 花生離體培養(yǎng)條件下不同外植體對(duì)青枯菌粗毒素的抗性反應(yīng)[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 25(5): 618-622.

[26]COUTINHO T A, ROUX J, RIEDEL K H, et al. First report of bacterial wilt caused byRalstoniasolanacearumon eucalypts in South Africa[J]. Forest Pathol, 2000, 30(4): 205-210.

【責(zé)任編輯 李曉卉】

Comparison of identification methods of bacterial wilt resistance in Casuarinaceae and screening of resistant germplasm resources

XU Xiuyu1,2， ZHANG Weiqiang2， HUANG Yuhui2， GAN Xianhua2， ZHONG Chonglu3， ZHANG Huaxin1

(1 Research Centre on Saline and Alkali Lands of State Forestry Administration，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China； 2 Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization/Guangdong Academy of Forestry，Guangzhou 510520，China； 3 Research Institute of Tropical Forestry，Chinese Academy of Forestry，Guangzhou 510520，China)

【Objective】 To select convenient, accurate and reliable identification methods of bacterial wilt resistance in Casuarinaceae, identify and evaluate the bacterial wilt resistance of Casuarinaceae germplasm resources in China, and screen out highly resistant clones.【Method】Based on the screening techniques of Casuarinaceae resistant lines as well as the identification methods of bacterial wilt in other plants, such asLycopersiconesculentum,NicotianaandEucalyptus, we designed eight different approaches to inoculateRalstoniasolanacearuminto Casuarinaceae. The effects of using hydroponic rooting seedling, twig, lignified green branch, lignified brown branch, bacterial wilt crude toxin, and root with or without injure of potted seedlings in inoculation on bacterial wilt resistance identification were studied. 【Result】After injured root inoculation of potted seedling，the mortalities of different Casuarinaceae clones ranged from 25.79% to 83.06% with significant differences among A14, K18 and G1, 30 clones(P<0.05). After hydroponic inoculation of lignified brown branch，the disease indexes of different clones ranged from 2.16 to 69.48 with significant differences among A14, K18 and G1, 30 clones(P<0.05). These two inoculation approaches enabled effective discrimination between resistant and infected clones, and had highly significant positive correlation (r=0.856 5). Non-injured root inoculation of potted seedling, hydroponic inoculation of rooting seedling and tender branch did not result in significantly differences in disease resistance among clones(P>0.05), and they couldn’t help with effective identification of bacterial wilt resistance in Casuarinaceae. Inoculation of lignified green branch only resulted in small differences among clones, and therefore it led to difficulties in classification and could easily cause detection error. The concentration of bacterial wilt crude toxin was hard to control during inoculation. Using hydroponic inoculation of lignified brown branch, 53 Casuarinaceae clones were evaluated and 12 highly resistant clones such as X1, 30, hybrid and G1 clones were screened out. 【Conclusion】 Injured root inoculation of potted seedling and hydroponic inoculation of lignified brown branch are both preferred inoculation approaches for identifying bacterial wilt resistance of Casuarinaceae. The rest inoculation approaches tested in this study were not suitable for identification of bacterial wilt resistance in Casuarinaceae.

Casuarinaceae； bacterial wilt； disease resistance； identification method； germplasm resource

2016- 10- 26 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-22

許秀玉(1977—)，女，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士研究生，E-mail：81250908@163.com；通信作者：張華新(1962—)，男，研究員，博士，E-mail：18611572609@163.com

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014KJCX017，2013KJCX018-03)

S432.4

A

1001- 411X(2017)04- 0087- 08

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170622.1010.006.html

許秀玉， 張衛(wèi)強(qiáng)， 黃鈺輝， 等.木麻黃青枯病抗性鑒定方法比較及抗病種質(zhì)篩選[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):87- 94.