羅六龍， 馬春全， 梁梓森

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528231)

3種高致病性豬藍(lán)耳病疫苗對仔豬免疫器官的損傷作用

羅六龍1,2， 馬春全2， 梁梓森1

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528231)

【目的】研究3種高致病性豬藍(lán)耳病(PRRS)疫苗(MLV、TJM92、JXA-1R)對仔豬免疫器官的損傷作用?！痉椒ā窟x取50頭初生健康仔豬，分為4組進(jìn)行免疫：未免疫空白對照組(CK組)、MLV疫苗免疫組(A組)、TJM92疫苗免疫組(B組)、 JXA-1R疫苗免疫組(C組)。病理剖檢后,制作石蠟切片，通過優(yōu)化的酯酶染色(α-ANE染色)、甲基綠-派洛寧染色(MG-P)方法統(tǒng)計各免疫器官的酯酶陽性T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(效應(yīng)B淋巴細(xì)胞)比率變化?！窘Y(jié)果】各免疫組的免疫器官酯酶陽性T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞所占百分比與對照組存在顯著或極顯著差異。【結(jié)論】3種疫苗對仔豬免疫器官均有不同程度的損傷作用，具體表現(xiàn)為JXA-1R疫苗損傷作用最強(qiáng)，TJM92疫苗次之，MLV疫苗最弱。

豬藍(lán)耳??； 疫苗； 損傷； 酯酶染色； 甲基綠-派洛寧染色； 仔豬； 免疫器官

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，俗名藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種接觸性和急性高致病性傳染病[1-2]。PRRS引起妊娠母豬的早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙，以及各種年齡豬(特別是仔豬)的呼吸系統(tǒng)癥狀、高死亡率和育成豬呼吸困難、發(fā)育遲緩等[3]。對藍(lán)耳病的防控，世界各國做法不一，歐美等國家主要采取生物安全的方法，我國主要采用疫苗進(jìn)行防控[4]，由于藍(lán)耳病病毒容易變異，疫苗種類繁多，質(zhì)量良莠不齊，使得我國藍(lán)耳病防控效果不盡理想，因此是否使用疫苗、如何選擇疫苗進(jìn)行防控，專家學(xué)者們意見不一。藍(lán)耳病是一種免疫抑制性疾病，藍(lán)耳病的疫苗是否對免疫器官有損傷作用，鮮有報道。因此，開展不同PRRS疫苗株對仔豬免疫系統(tǒng)的免疫損傷的研究對于指導(dǎo)PRRS的防控及防控中PRRS疫苗的選用具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 21 d斷奶的健康保育豬50頭，PRRSV抗原及抗體均為陰性，CSFV及PRV抗原陰性(-)，PCV-2核酸檢測陰性，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化試驗動物中心飼養(yǎng)。

1.1.2 疫苗及試劑 Ingelvac MycoFLEX?、Ingelvac CircoFLEX?疫苗、Ingelvac? PRRS MLV、TJM92疫苗，碩騰公司生產(chǎn)；JXA-1R疫苗，普萊柯公司生產(chǎn)。ANAE萘乙酸染色液(酯酶染色)、甲基綠-派洛寧染色液、ANAE萘乙酸(粉末)、鹽酸付玫瑰苯胺(品紅，粉末)等，購自廣州鼎國生物科技有限公司。

無水乙醇、無水丙酮、二甲苯(分析純)、三氯甲烷、亞硝酸鈉(晶體)、中性樹膠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等，購自佛山安洋化玻有限公司。

1.1.3 試驗儀器 LEICA? RM-2016生物切片機(jī)、KD-BM生物組織包埋機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司生產(chǎn)；KD-T生物組織攤烤片機(jī)，金華科迪儀器有限公司生產(chǎn)；DK-8D恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；恒溫干燥箱，廣州博造機(jī)械設(shè)備有限公司生產(chǎn)；美的電冰箱，合肥美的榮事達(dá)電器有限公司生產(chǎn)；顯微鏡、研究及熒光倒置顯微系統(tǒng)、CX-31顯微成像裝置，Olympus(中國)有限公司生產(chǎn)；電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組及免疫攻毒 選取50頭新生健康仔豬，1～2 日齡疫苗滴鼻，14日齡注射Ingelvac MycoFLEX?和Ingelvac CircoFLEX?疫苗。21日齡斷奶后，分組運(yùn)送至華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗動物中心，飼養(yǎng)至24日齡。

50頭健康仔豬分為4組。未免疫空白對照組(CK組)：生理鹽水肌肉注射，每頭2 mL，共5頭； MLV疫苗免疫組(A組)：15頭，每頭MLV疫苗肌肉注射2 mL；TJM92疫苗免疫組(B組)：15頭，每頭TJM92疫苗肌肉注射2 mL；JXA-1R疫苗免疫組(C組)：15頭，每頭JXA-1R疫苗肌肉注射2 mL。

飼養(yǎng)至24日齡進(jìn)行疫苗免疫，免疫14 d后剖殺部分豬。

1.2.2 病理剖檢及標(biāo)本采集 接種疫苗后14 d，即38日齡，剖殺部分豬。解剖后采集脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體等免疫器官的組織樣本。

1.2.3 病料組織處理 蒸餾水洗凈組織塊上的血漬，用100 mL·L-1的甲醛溶液固定組織，置于標(biāo)本瓶中保存，儲藏于干燥、室溫環(huán)境中，處理24 h后，制作石蠟切片，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病料染色及鏡檢 通過優(yōu)化方法篩選出的最適條件(酯酶染色：脾、淋巴結(jié)和扁桃體的酯酶染色最適條件不盡相同——脾采用丙酮脫蠟，而淋巴結(jié)和扁桃體則適用乙醇脫蠟，三者都無需固定；均使用自配孵育液孵育，時間分別為1、1和2 h；均使用甲基綠作為復(fù)染液，時間分別為10、5和10 min。甲基綠-派洛寧染色的最適條件：脾、淋巴結(jié)和扁桃體均為丙酮脫蠟+染色80 min+分化脫水)，對采集的脾臟、扁桃體和淋巴結(jié)等組織分別進(jìn)行酯酶染色和甲基綠-派洛寧染色。制作石蠟切片，鏡檢：脾選取動脈周圍淋巴鞘和小梁周圍各2個視野，統(tǒng)計酯酶陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)量，取平均值，試驗組與對照組比對；選取脾小體2個視野，統(tǒng)計效應(yīng)B淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞)數(shù)量，取平均值，試驗組與對照組比對；淋巴結(jié)選取淋巴小結(jié)生發(fā)中心2個視野，統(tǒng)計B淋巴細(xì)胞數(shù)量，選取胸腺依賴區(qū)2個視野，統(tǒng)計酯酶陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)量，均計算平均值，試驗組和對照組比對；扁桃體取2個視野，統(tǒng)計酯酶陽性T細(xì)胞、效應(yīng)B淋巴細(xì)胞數(shù)量，各取平均值，試驗組和對照組比對。綜合各器官數(shù)據(jù)，評價免疫器官免疫后損傷情況。

酯酶染色后應(yīng)為胞核染成紅棕色或暗紅色，胞質(zhì)為綠色，而陽性T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)有界限清晰的紅棕色(橘紅色)顆粒，顆粒的形態(tài)、數(shù)目、大小均不一。甲基綠-派洛寧染色后應(yīng)為陽性漿細(xì)胞(效應(yīng)B細(xì)胞)胞核綠色或藍(lán)綠色，胞質(zhì)為紅色或紅紫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢病變

接種疫苗后14 d，即38日齡，剖殺部分豬，發(fā)現(xiàn)對照組胸腔、腹腔內(nèi)有大量黃色積液和纖維性滲出物，呈現(xiàn)多發(fā)性漿液纖維素性胸膜炎和腹膜炎，肺臟大面積充血水腫，腹股溝淋巴結(jié)和肺門淋巴結(jié)明顯腫大。部分病死豬腎臟腫大，呈褐色或土黃色，質(zhì)地較脆，有淤血現(xiàn)象，脾臟腫大、質(zhì)脆；膀胱內(nèi)尿液渾濁呈茶色；個別豬有消化道病變，主要表現(xiàn)為胃黏膜大面積充血、出血。

2.2 試驗豬免疫器官酯酶及甲基綠-派洛寧染色結(jié)果

將統(tǒng)計的免疫后試驗組(A、B、C組)和對照組(CK組)脾臟、淋巴結(jié)及扁桃體的酯酶陽性T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的數(shù)量百分比數(shù)據(jù)代入統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS20.0 for Windows 中的相關(guān)分析公式中，試驗組之間不做比較，而各試驗組與對照組兩兩比較，分析結(jié)果如圖1、圖2所示。

從圖1可以看出，免疫后B組、C組脾動脈周圍淋巴鞘的酯酶陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)量比與CK組存在極顯著差異，A組差異不顯著；免疫后A、B、C組脾小梁的酯酶陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)量比與CK組均存在極顯著差異；免疫后，A組淋巴結(jié)胸腺依賴區(qū)的酯酶陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)量比與CK組存在顯著差異，B、C組與CK組存在極顯著差異；免疫后B組扁桃體的酯酶陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)量比與CK組存在顯著差異，A、C組與CK組存在極顯著差異。

*和**分別表示試驗組與CK組差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(t檢驗)。

圖1 免疫后各免疫器官組織的酯酶陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)量比

Fig.1 Percentages of esterase positive T-cells in different immune organs after immunization

*和**分別表示試驗組與CK組差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(t檢驗)。

圖2 免疫后各免疫器官組織的漿細(xì)胞數(shù)量比

Fig.2 Percentages of plasma cells in different immune organs after immunization

從圖2可以看出，A組脾小體漿細(xì)胞數(shù)量比與CK組差異顯著，B組與CK組差異不顯著，C組與CK組差異極顯著；A、B、C組淋巴結(jié)生發(fā)中心漿細(xì)胞數(shù)量比與CK組均存在極顯著差異；A組扁桃體漿細(xì)胞數(shù)量比與CK組存在顯著差異，C組扁桃體漿細(xì)胞數(shù)量比與CK組存在極顯著差異，B組與CK組差異不顯著。

圖1、圖2表明，脾的損傷C組>B組>A組；淋巴的損傷B組>C組>A組；扁桃體的損傷C組>A組>B組。綜合來看，JXA-1R疫苗的損傷作用最強(qiáng)，TJM92疫苗次之，MLV疫苗最弱。

3 討論與結(jié)論

李華等[5]采用流式細(xì)胞儀，對淋巴組織的細(xì)胞進(jìn)行了分析；聶立欣等[6]通過酯酶染色和甲基綠-派洛寧染色統(tǒng)計分析了T、B淋巴細(xì)胞的變化；本研究得到的數(shù)據(jù)與李華、聶立欣等的結(jié)果基本相符。王建等[7]、胡守萍等[8]通過分子生物學(xué)方法研究了PRRSV 變異株(JXA1-R)弱毒疫苗、經(jīng)典PRRSV(VR 2332)弱毒疫苗、變異株(JXA1)滅活疫苗對仔豬肺和免疫器官的保護(hù)作用(疫苗效價)，弱毒苗的保護(hù)作用之間差異不顯著，而滅活苗保護(hù)效果不佳。然而，不論是何種疫苗，關(guān)于疫苗本身對仔豬免疫器官有無損傷及損傷程度卻鮮有研究報道。本研究通過對仔豬脾、淋巴結(jié)、扁桃體組織樣品做酯酶染色及甲基綠-派洛寧染色，得出酯酶陽性T淋巴細(xì)胞的變化，結(jié)合脾、淋巴結(jié)、扁桃體裸眼觀查病變和剖檢大體病變，以及試驗組和對照組的比較，證實(shí)PRRS弱毒疫苗對免疫器官有一定的損傷作用。Morgan等[9]研究表明，組織病理變化嚴(yán)重程度與PRRSV 感染細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，佐證了本文的研究。

目前，PRRS沒有可供治療的特效藥物，已有的疫苗效果也不盡理想。加之流行病毒毒株的不斷變異，以及混合感染、繼發(fā)感染、交叉感染的頻繁發(fā)生，使得PRRS的防控面臨著更大的挑戰(zhàn)。人們一開始關(guān)注的是，PRRS對繁殖功能以及呼吸道產(chǎn)生的影響，如今，人們將更多的目光投向PRRS的免疫抑制作用上。本研究用的弱毒疫苗分別是經(jīng)典株(MLV疫苗，A組)、天津變異株(TJM92疫苗，B組)、江西變異株(JXA-1R疫苗，C組)，C組攻毒后的淋巴細(xì)胞變化與王建等[7]的試驗結(jié)果相吻合。鄧博文等[10]通過流行病學(xué)調(diào)查等認(rèn)為，PRRS防治不能只采取特異性免疫，應(yīng)當(dāng)因地制宜開展綜合性措施。疫苗的作用與當(dāng)?shù)氐牟《局晷?、飼養(yǎng)環(huán)境、傳染病史等密切相關(guān)[11]，所以本研究得到的數(shù)據(jù)能為疫苗的選用提供依據(jù)，而具體的防控措施以及應(yīng)對PRRS的辦法還需繼續(xù)探究。

本研究在對豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫后及強(qiáng)毒攻擊后豬的臨床表現(xiàn)、裸眼觀查病理變化和剖檢病理變化的基礎(chǔ)上，通過α-NAE染色法以及甲基綠-派洛寧染色法系統(tǒng)地分析與評價了疫苗對仔豬免疫器官的損傷作用。利用病理變化、陽性T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的變化及其和對照組的差異性情況分析評價了PRRS疫苗本身對機(jī)體免疫器官(脾、淋巴、扁桃體等)的損傷作用，證實(shí)了疫苗本身對仔豬免疫器官有不同程度的損傷作用。不足之處在于，本研究選用的疫苗均為弱毒苗，無法和其他種類疫苗進(jìn)行比較。試驗結(jié)果表明，疫苗本身對免疫器官和肺的損傷作用可成為今后疫苗研制和豬場疫苗選用的重要依據(jù)指標(biāo)，國內(nèi)外的各種疫苗都可以做這方面研究，研究的方法和思路都有待拓寬，得出綜合全面的數(shù)據(jù)。

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【責(zé)任編輯 李曉卉】

Injury to immune organs of piglets from three kinds of PRRS vaccine

LUO Liulong1,2, MA Chunquan2, LIANG Zisen1

(1 College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2 Foshan University,Foshan 528231,China)

【Objective】 To study the injury to immune organs of piglets from three kinds of PRRS vaccine(MLV, TJM 92 and JXA-1R vaccines).【Method】Fifty new-born healthy piglets were devided into four groups：non-immunized control group(CK group), MLV vaccine group(A group), TJM 92 vaccine group (B group), JXA-1R vaccine group (C group). Every piglit in the experimental group were vaccinated. Then paraffin sections were prepared after pathological anatomy. Changes in percentages of esterase-positive T cells and plasma cells (effector B cells) of different immune organs were summarized by using optimized esterase (α-NAE) and methyl green-pyronin (MG-P) staining. 【Result】There were significant or highly significant differences in the percentages of esterase-positive T cells and plasma cells of immune organs between each immunized group and CK group. 【Conclusion】Three kinds of vaccine all have injuries to immune organs of piglets. Injury from JXA-1R vaccine is the strongest, followed by TJM92 vaccine and then MLV vaccine.

porcine reproductive and respiratory syndrome; vaccine; injury; esterase staining; methyl green-pyronin staining； piglet； immune organ

2016- 09- 17 優(yōu)先出版時間：2017- 06-21

羅六龍(1991—)，男，碩士，E-mail：395280165@qq.com; 通信作者：馬春全(1962—)，男，教授，博士，E-mail: machunquan@263.net；梁梓森(1957—)，男，教授，博士，E-mail:liangzisen@scau.edu.cn

廣東高校畜禽疾病診斷防控技術(shù)開發(fā)中心資助項目(GCZX-B1102)

S853.3

A

1001- 411X(2017)04- 0076- 04

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170622.1009.002.html

羅六龍， 馬春全， 梁梓森.3種高致病性豬藍(lán)耳病疫苗對仔豬免疫器官的損傷作用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(4):76- 79.