向正剛， 耿 毅， 張雨薇， 楊澤曉， 歐陽萍， 李亞軍， 牟維豪， 王世震

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 611130)

四川兔源金黃色葡萄球菌毒力檢測及分子分型

向正剛， 耿 毅， 張雨薇， 楊澤曉， 歐陽萍， 李亞軍， 牟維豪， 王世震

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 611130)

【目的】研究四川部分區(qū)域兔源金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的基因型總體結(jié)構(gòu)特征、遺傳變異以及毒力因子的分布情況?！痉椒ā繌乃拇ǖ貐^(qū)分離41株兔源金黃色葡萄球菌，鑒定femB基因特異性， 進(jìn)行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantS.aureus, MRSA)篩選，并通過PCR法檢測13種常見的毒力基因，采用多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)和脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)確定基因型特征?！窘Y(jié)果】41株金黃色葡萄球菌中共檢測出MRSA 31株，檢出率為75.61%；共檢出9種毒力基因，其中nuc、hla、eta和clfA在所有菌株中均存在，而sea、sec、see、hlb和PVL的陽性檢出率分別為9.7%、85.4%、80.5%、90.2%和7.3%。MLST 分型結(jié)果顯示，41株金黃色葡萄球菌只存在2種序列型(ST398、ST3320)和1個(gè)克隆群CC398，其中ST398為優(yōu)勢序列型，所占比例為97.6%。PFGE將41株金黃色葡萄球菌分為18個(gè)基因型，但不同區(qū)域間的基因型條帶差異較小?！窘Y(jié)論】四川調(diào)查區(qū)域兔源金黃色葡萄球菌毒力因子攜帶率較高，其對家兔的養(yǎng)殖業(yè)存在較大的安全威脅； 分型分析說明四川部分區(qū)域金黃色葡萄球菌的主要流行菌株遺傳變異程度小，菌株間親緣關(guān)系較近。

金黃色葡萄球菌； 家兔； 毒力基因； 多位點(diǎn)序列分型； 脈沖場凝膠電泳； 基因分型

金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus屬于葡萄球菌屬，在全球范圍廣泛存在，是重要的人獸共患病原菌[1]。它不僅能感染人類引起化膿性關(guān)節(jié)炎、壞死性肺炎和敗血癥等，引起死亡[2]，在養(yǎng)殖業(yè)上還能感染家兔[3]、雞[4]和牛[5]等多種動(dòng)物。自1961年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantS.aureus, MRSA)首次被鑒定以來[6]，MRSA對幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素高度耐藥，導(dǎo)致該病的控制更加困難[7]，而金黃色葡萄球菌致病力強(qiáng)弱與其產(chǎn)生的毒素及侵襲性酶密切相關(guān)，如腸毒素、中毒休克綜合癥毒素和粘附因子等[8]。這些毒力因子在金黃色葡萄球菌感染致病過程中起著重要作用。

金黃色葡萄球菌的分子分型有助于了解其流行病學(xué)特征，鑒定主要流行菌株的分子特征，對控制克隆株的傳播具有重要的意義。目前常用的金黃色葡萄球菌分子分型的方法有SCCmec分型[9]、多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)[10]和脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)[11]等。其中，MLST分型是基于金黃色葡萄球菌的7個(gè)管家基因擴(kuò)增測序[12]，并在MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，該方法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)便于保存，可用于大規(guī)模和長期的流行病學(xué)監(jiān)控。PFGE基因分型主要是基于金黃色葡萄球菌DNA的原位酶切，可用于分析菌株之間遺傳相關(guān)性[13]。本研究在檢測金黃色葡萄球菌常見的13種毒力因子的基礎(chǔ)上，結(jié)合MLST和PFGE基因分型方法鑒定41株兔源金黃色葡萄球菌的基因型特征，為金黃色葡萄球菌疾病的傳播和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

41株兔源金黃色葡萄球菌分離自四川成都、樂山、德陽、自貢、眉山和南充等規(guī)?；脠?，2014—2016年采集的膿液樣本由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。成都菌株編號(hào)為A01～A04，樂山菌株編號(hào)為N01～N05，德陽菌株編號(hào)為G01～G04，自貢菌株編號(hào)為D01～D15，眉山菌株編號(hào)為H01～H03，南充菌株編號(hào)為Y01～Y10。

1.2 試劑與儀器

細(xì)菌DNA抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；溶菌酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SmaI限制性內(nèi)切酶和蛋白酶K購自大連TaKaRa公司； GelDoc2000凝膠成像分析系統(tǒng)、Pulsed Field Certified Agarose和CHEF Mapper XA 系統(tǒng)均購自 Bio-Rad公司。

1.3 菌株復(fù)蘇、特異性鑒定與MRSA篩選

取-80 ℃凍存菌株接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察其菌落形態(tài)，并革蘭染色鏡檢；進(jìn)一步對菌株進(jìn)行PCR特異性鑒定及MRSA的篩選，MRSA篩選之后剩余的菌株則為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MethicillinsensitiveS.aureus,MSSA)。參考文獻(xiàn)[14]中金黃色葡萄球菌特異性基因femB和β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥基因mecA的引物序列，并送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，預(yù)期擴(kuò)增目的片段長度分別為651和533 bp。PCR反應(yīng)體系為：PCR Master Mix(2×)12.5 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL， DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，47 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次； 72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g·L-1瓊脂糖凝膠、120 V電泳15 min鑒定。

1.4 毒力因子檢測

參考Jarraud等[15]和Peacock等[16]報(bào)道文獻(xiàn)中金黃色葡萄球菌的毒力因子，選取13個(gè)常見的毒力基因進(jìn)行PCR檢測：腸毒素基因(sea、seb、sec、sed、see)，溶血素基因(hla、hlb)，中毒休克綜合征毒素基因TSST-1，表皮剝脫素基因(eta、etb)，黏附素基因clfA，侵襲毒素基因nuc，殺白細(xì)胞素基因PVL。具體引物序列及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[15-16]進(jìn)行，引物送蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g·L-1瓊脂糖凝膠、120 V電泳15 min后觀察結(jié)果。

1.5 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

選取金黃色葡萄球菌的7個(gè)管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列登錄金黃色葡萄球菌多位點(diǎn)序列分型網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/saureus/info/primers.shtml)下載，并由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：PCR Master Mix(2×)12.5 μL，10 μmol· L-1的上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL， ddH2O 8.5 μL， 共25 μL。循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在http://pubmlst.org/網(wǎng)站進(jìn)行比對，獲得等位基因編號(hào)和序列號(hào)(Sequence type, ST)，并通過eBURST軟件進(jìn)行克隆群(Clonal complex，CC)的劃分與分析。

1.6 脈沖場凝膠電泳(PFGE)及聚類分析

[17]中的方法，首先用細(xì)胞懸濁液CSB(100 mmol·L-1Tris-HCl、100 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)沖洗并收集菌體，制成細(xì)菌懸濁液；接著用10 mg·mL-1的溶菌酶、 20 mg·mL-1的蛋白酶K和1 mg·mL-1的溶葡萄球菌素酶消化細(xì)菌；并將細(xì)菌懸濁液與凝膠溶液等體積混合制成膠塊。細(xì)菌基因組DNA用50 U的SmaI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，在CHEF Mapper XA進(jìn)行電泳，電泳程序：電泳時(shí)間為16 h，電壓為6 V，電泳夾角為120°，脈沖時(shí)間為4～40 s，電泳溫度14 ℃。電泳后用GoldView核酸染色劑對電泳膠進(jìn)行染色，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像。最后圖片由Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行基因差異性分析，采用非加權(quán)組平均法對PFGE圖像進(jìn)行聚類，用相似性系數(shù)衡量PFGE帶型的相似程度[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株特異性鑒定及MRSA篩選

41株兔源金黃色葡萄球菌在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，均形成表面光滑、厚、圓形隆起、濕潤、邊緣整齊的菌落。革蘭染色鏡檢為球形，成對或形成像葡萄狀成串的G+菌。41株分離菌femB基因特異性PCR鑒定結(jié)果顯示均可擴(kuò)增出長度約為651 bp的特異性條帶(圖1)，結(jié)合形態(tài)學(xué)與PCR檢測結(jié)果表明41株菌株均為金黃色葡萄球菌。同時(shí)，mecA基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，41株金黃色葡萄球菌中共31耐藥基因mecA陽性，確認(rèn)為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，檢出率為75.61%。

M：DL2000 Marker：1：A01；2：G01；3：H01；4：D15；5：Y09；6：N04；7：陰性對照。

圖1 部分代表菌株的femB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplication offemBgene of partial representative strains

2.2 毒力基因檢測結(jié)果

對41株兔源金黃色葡萄球菌毒力基因的PCR檢測結(jié)果顯示(表1)，此次試驗(yàn)共檢測出nuc、sea、sec、see、hla、hlb、PVL、eta、clfA9種毒力基因，但seb、sed、TSST-1和etb基因未檢測出。且結(jié)果顯示，nuc、eta、clfA和hla在MSSA和MRSA菌株中的陽性檢出率相同，均為100.0%。sea、sec、see、hlb和PVL在MSSA菌株的陽性檢出率分別為20.0%、90.0%、80.0%、100.0%和20.0%，在MRSA菌株的陽性檢出率分別為6.5%、83.9%、80.6%、87.1%和3.2%，在41株菌株的陽性檢出率共計(jì)分別為9.7%、85.4%、80.5%、90.2%和7.3%?？梢钥闯鯩SSA菌株保持了相當(dāng)高的毒力，而MRSA菌株的毒力稍弱。絕大部分菌株(90.2%)均同時(shí)攜帶2種溶血素基因(hla、hlb)。其中自貢和樂山的菌株毒力基因檢出的種類最多，共9種；而南充、德陽、成都和眉山的菌株檢測出的毒力基因有7種。

表1 兔源金黃色葡萄球菌毒力基因的檢測結(jié)果1)Tab.1 PCR detection of virulence genes of Staphylococcus aureus isolated from rabbit

1)檢出率：指陽性檢出率，株數(shù)：指革蘭染色陽性的菌株數(shù)；菌株D01～D15來源于自貢，Y01～Y10來源于南充，N01～N05來源于樂山，A01～A04來源于成都，G01～G04來源于德陽，H01～H03來源于眉山。

2.3 MLST分析

如表2和圖2所示，41株金黃色葡萄球菌只存在2種序列型(ST398、ST3320)和1個(gè)克隆群CC398。其中ST3320是ST398的克隆衍生物， ST3320和ST398有單一位點(diǎn)的差異。ST398為本次試驗(yàn)菌株中的優(yōu)勢序列型，占97.6%。只有分離自樂山的N04菌株為ST3320，其余區(qū)域的菌株序列型均相同，為ST398。其中10株MSSA菌株均屬于序列型ST398，31株MRSA菌株中30株屬于序列型ST398，只有1株為序列型ST3320。但MSSA菌株和MRSA菌株均同屬于1個(gè)克隆群CC398。

表2 金黃色葡萄球菌基本信息、等位基因編號(hào)及序列號(hào)Tab.2 Basic information, allele numbers and sequence types of Staphylococcus aureus strains

每個(gè)ST用1個(gè)圓點(diǎn)表示; 位于聚類中心的圓點(diǎn)是主要的創(chuàng)建者(藍(lán)色)或者子群創(chuàng)建者(黃色); 紅色的圓圈表明此ST是在本次試驗(yàn)菌株中發(fā)現(xiàn)的，且用箭頭標(biāo)記。

圖2 金黃色葡萄球菌eBRUST圖
Fig.2 eBURST diagram ofStaphylococcusaureuspopulation

2.4 PFGE分型分析

41株兔源金黃色葡萄球菌聚類分18個(gè)PFGE帶型(圖3)。其中有8個(gè)帶型是只包含單一菌株的譜型(Cluster B、E、G、I、J、K、N、Q)，其余帶型均以77%以上的相似性聚類。有8個(gè)帶型中包含的金黃色葡萄球菌分離來自四川不同區(qū)域(Cluster D、F、H、L、M、O、P、R)。只有Cluster A和Cluster C含有的菌株均分離于同一區(qū)域(自貢)。由圖3可以看出在相似性聚類上，只有Cluster O、P同時(shí)包含MSSA菌株和MRSA菌株。

3 討論與結(jié)論

金黃色葡萄球菌是引起人類和動(dòng)物感染疾病的重要病原菌之一，可產(chǎn)生多種致病因子，現(xiàn)共檢測出了超過30種以上的毒力因子，主要是在侵襲組織、逃避宿主免疫等方面起著重要作用[19]，但不同菌株所攜帶的毒力因子存在一定的差異。本研究通過PCR檢測13種金黃色葡萄球菌常見的毒力基因的分布情況。結(jié)果顯示，nuc、hla、eta和clfA在所有菌株中均存在，而除了seb、sed、TSST-1和etb之外，sea、sec、see、hlb和PVL均有不同程度的檢出，其陽性檢出率分別為9.7%、85.4%、80.5%、90.2%和7.3%。而MSSA菌株的毒力因子陽性檢出率要略高于MRSA菌株，可以看出相較之下MSSA菌株保持了較高的毒力，MRSA菌株的毒力則較弱，這與陸軍等[20]報(bào)道的不同來源金黃色葡萄球菌毒力基因的攜帶情況相似。所有檢測菌株至少攜帶7種以上的毒力因子，其中溶血素是金黃色葡萄球菌的主要毒力因子之一，有報(bào)道稱人源金黃色葡萄球菌主要產(chǎn)α溶血素，而從動(dòng)物分離的金黃色葡萄球菌主要產(chǎn)β溶血素[21]。但本試驗(yàn)中，所有兔源金黃色葡萄球菌均存在α溶血因子，部分菌株同時(shí)攜帶α和β溶血因子，檢出率為90.2%。而PVL是有l(wèi)ukF-PV和lukS-PV基因共同編碼的一種雙組份成孔蛋白，可引起皮膚壞死、毛細(xì)血管擴(kuò)張、白細(xì)胞滲出等[22]。PVL基因曾被認(rèn)為在金黃色葡萄球菌中的存在率不到5%[23]，但PVL基因與MRSA引起的感染密切相關(guān)，PVL基因的檢出率不斷升高，Gillet等[24]報(bào)道人源金黃色葡萄球菌中PVL基因的檢出率為9.0%，童俊等[25]報(bào)道的研究中PVL基因的檢出率高達(dá)11.7%。在本研究中41株兔源金黃色葡萄球菌共檢出3株P(guān)VL基因陽性菌株，檢出率為7.3%，雖然其檢出率較目前人源金色葡萄球菌低，但也值得我們進(jìn)一步關(guān)注兔源金色葡萄球菌PVL基因的攜帶率是否會(huì)不斷增加，從而增強(qiáng)金色葡萄球菌對家兔的致病風(fēng)險(xiǎn)。

在分析了41株四川部分區(qū)域兔源金黃色葡萄球菌的毒力因子分布情況的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了MLST和PFGE基因分型的研究。MLST分型結(jié)果顯示，41株金黃色葡萄球菌共鑒定出2種ST序列型(ST398、ST3320)和1個(gè)克隆群CC398。其中ST398為優(yōu)勢序列型(97.6%)，且ST398為克隆群的主要?jiǎng)?chuàng)建者，而ST3320和ST398有單一位點(diǎn)的差異，二者只在gmk位點(diǎn)的基因序列存在差異，說明這2個(gè)序列型遺傳關(guān)系較近。MSSA菌株只分出1種序列型ST398，而MRSA分出2種序列型ST3320和ST398，相比之下MRSA菌株表現(xiàn)出了克隆多樣性，其中以ST398為主，占96.8%。有報(bào)道稱世界大部分國家的主要流行菌株序列型為ST239，其次為ST5[26]；我國大部分地區(qū)主要流行菌株序列型為ST239[27]。但也有在法國和北美ST398克隆株引起人類嚴(yán)重感染的報(bào)道[28-29]，且ST398最初報(bào)道是分離于家畜[30]，說明不同區(qū)域金黃色葡萄球菌的主要流行序列型存在差異。PFGE分型結(jié)果顯示，41株四川部分區(qū)域兔源金黃色葡萄球菌都能被PFGE法分型。在PFGE基因分型中，序列型為ST398-MRSA和ST3320-MRSA的菌株可被同時(shí)聚類到Cluster R中，且分型為ST398-MSSA的菌株在聚類分析中相對較為集中，基因型差異較小。只有Cluster O、P 2個(gè)簇中同時(shí)包含了ST398-MSSA和ST398-MRSA菌株，說明四川部分地區(qū)序列型相同的金黃色葡萄球菌中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌的基因型差異不大。PFGE聚類分為18個(gè)基因型，其中四川地區(qū)不同區(qū)域的菌株可被劃分在同一PFGE基因型中，而同一區(qū)域的菌株又可存在于不同的PFGE基因型中，且PFGE分型的各基因型條帶差異較小，說明四川部分區(qū)域間金黃色葡萄球菌的遺傳變異程度小，菌株間親緣關(guān)系較近。

本研究結(jié)果表明，四川部分區(qū)域兔源金黃色葡萄球菌的毒力因子攜帶率較高，具有較強(qiáng)的致病力。分子分型發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)不同區(qū)域間菌株的基因型差異小，親緣關(guān)系較近?？紤]到樣本量較少，后續(xù)將在四川更多區(qū)域分離兔源金黃色葡萄球菌補(bǔ)充分子分型的研究信息，這對進(jìn)一步了解四川地區(qū)金黃色葡萄球菌菌株的分子流行情況和基因型總體結(jié)構(gòu)特征具有重要意義。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Virulence detection and molecular typing of Staphylococcus aureus isolated from rabbit in Sichuan area

XIANG Zhenggang, GENG Yi, ZHANG Yuwei, YANG Zexiao, OUYANG Ping, LI Yajun, MOU Weihao, WANG Shizhen

(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

【Objective】 To understand genotyping characteristics, genetic variation and the distribution of virulence factors ofStaphylococcusaureusisolated from rabbits in Sichuan area. 【Method】Forty-oneS.aureusstrains were isolated from rabbits in Sichuan area. The strains were identified forfemBgene specifity. Methicillin-resistantS.aureus(MRSA) were screened out. Thirteen common virulence genes were detected using PCR. Genotyping characteristics were studied by using multilocus sequence typing (MLST) and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). 【Result】There were 31 MRSA strains out of 41S.aureusstrains, and the detection rate was 75.61%. Totally nine virulence genes were detected,nuc,hla,etaandclfAgenes existed in all strains, and the positive detection rates ofsea,sec,see,hlbandPVLgenes were 9.7%, 85.4%, 80.5%, 90.2% and 7.3%, respectively. MLST results showed that 41S.aureusstrains belonged to two sequence types (ST398, ST3320) and one clonal complex CC398. ST398 was the preponderant sequence type, and the proportion was 97.6%. PFGE analysis divided 41S.aureusstrains into 18 banding types, whereas strains from different regions had low variation in banding patterns.【Conclusion】S.aureusstrains isolated from rabbits in Sichuan area have high carrying rates of virulence factors, and therefore are potential security risk to rabbit farming industry. The genotyping analysis indicates that the prevalent strains ofS.aureusisolated from parts of Sichuan Province have low genetic variation, and there are close genetic relationships among different strains.

Staphylococcusaureus; rabbit; virulence gene; multilocus sequence typing; pulsed field gel electrophoresis; genotyping

2016- 10- 27 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-21

向正剛(1990—)，男，碩士研究生； 通信作者：耿 毅(1974—)，男，教授，博士，Email: gengyisicau@126.com

四川省科技支撐計(jì)劃(2016NZ0002)

S941.41

A

1001- 411X(2017)04- 0062- 07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.022.html

向正剛， 耿 毅， 張雨薇， 等.四川兔源金黃色葡萄球菌毒力檢測及分子分型[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):62- 68.