胡 鈺，吳大威，翟秀宇，陳 默，王遠(yuǎn)濤*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 泌尿外二科)

小鼠皮膚心臟聯(lián)合移植模型的建立及移植物功能監(jiān)測(cè)

胡 鈺1，吳大威2，翟秀宇2，陳 默2，王遠(yuǎn)濤2*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 泌尿外二科)

目的 探討小鼠皮膚心臟聯(lián)合移植模型的建立及移植物功能的監(jiān)測(cè)。方法 以BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠做為供、受者，單純皮膚移植組采用尾-背法行皮膚移植，單純心臟移植組采用腹腔異位心臟移植法行心臟移植，皮膚心臟聯(lián)合移植組序貫采用尾-背皮膚移植及腹腔異位心臟移植模型。術(shù)后采用腹部觸診的方法，監(jiān)測(cè)心臟移植物功能，通過(guò)觀察殘存移植皮片大小，監(jiān)測(cè)皮膚移植物功能。結(jié)果 皮膚心臟聯(lián)合移植組皮膚移植物存活時(shí)間較單純皮膚移植組略有延長(zhǎng)(皮膚心臟聯(lián)合移植物v.s.單純皮膚移植組，8天v.s.7天)，但兩組皮膚移植物存活時(shí)間比較沒(méi)有顯著差別(P=0.1290)。單純心臟移植組心臟移植物和皮膚心臟聯(lián)合移植組心臟移植物平均存活時(shí)間均為9天(MST=9天)，兩組心臟移植物存活時(shí)間無(wú)顯著差別(P=0.6077)。結(jié)論 小鼠皮膚心臟聯(lián)合移植模型穩(wěn)定，移植物功能監(jiān)測(cè)簡(jiǎn)單方便，適用于移植免疫學(xué)方面的研究。

移植；模型；小鼠

(ChinJLabDiagn,2017,21:1256)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了各種轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠，為研究移植免疫反應(yīng)提供了更多的工具。1973年Corry等[1]建立了小鼠腹部心臟移植模型，因其屬于血管化器官移植模型，排斥反應(yīng)強(qiáng)度中等，術(shù)后監(jiān)測(cè)簡(jiǎn)便，且小鼠具有品系較純、試劑來(lái)源廣、免疫學(xué)檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于移植免疫學(xué)研究中。而小鼠皮膚移植模型是研究免疫排斥反應(yīng)的基本方法之一[2]，皮膚移植物內(nèi)有含有較多的樹(shù)突狀細(xì)胞，因此最容易發(fā)生快速且嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，所以在移植免疫學(xué)研究中常用皮膚移植來(lái)檢測(cè)排斥或耐受[3]。本實(shí)驗(yàn)借鑒了原有的皮膚及心臟移植手術(shù)技術(shù)，建立了小鼠皮膚心臟聯(lián)合移植模型，沒(méi)有增加手術(shù)難度，結(jié)果穩(wěn)定，移植物功能監(jiān)測(cè)簡(jiǎn)便，為移植免疫學(xué)研究提供了一種新的小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

C57BL/6小鼠60只,BALB/C小鼠45只，均為雌性，約6-8周齡,體重約20 g左右，所有試驗(yàn)用小鼠均來(lái)源于吉林大學(xué)第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。單純皮膚移植組：BALB/C小鼠5只作為供體，C57BL/C小鼠20只作受體，單純行尾-背皮膚移植；單純心臟移植組：BALB/C小鼠20只作為供體，C57BL/C小鼠20只作受體，單純行腹部異位心臟移植。皮膚心臟聯(lián)合移植組：BALB/C小鼠20只作為供體，C57BL/C小鼠20只作受體，先行尾-背皮膚移植后，立即行腹部異位心臟移植。

1.2 手術(shù)器械及試劑

手術(shù)顯微鏡一臺(tái)購(gòu)于日本徠卡公司;顯微手術(shù)器械購(gòu)于德國(guó)Roboz公司;10-0血管縫合線購(gòu)自美國(guó)Ethicon;其他絲線均購(gòu)自上海醫(yī)用縫合線廠;油沙條購(gòu)于美國(guó) Gauze，邦迪創(chuàng)可貼購(gòu)于美國(guó)Johnson。水合氯醛及肝素由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.3 小鼠腹部異位心臟移植方法

1.3.1 供心制備 麻醉采取4%水合氯醛(10-12 μl/g) 腹腔注射。供鼠麻醉成功后,供鼠取仰臥位，四肢向外伸展后用3M貼固定于鼠板上。術(shù)區(qū)剃毛、消毒后，取劍突下至恥骨聯(lián)合縱行切口進(jìn)入腹腔,撥開(kāi)腸管顯露下腔靜脈，并經(jīng)下腔靜脈注入1%肝素鹽水0.3 ml肝素化，剪斷腹主動(dòng)脈并向上剪開(kāi)胸骨、膈肌，暴露心臟。6-0絲線結(jié)扎下腔靜脈，集束結(jié)扎右肺門處脈管后去除右肺。于肺動(dòng)脈分叉處橫斷；30G細(xì)針穿刺升主動(dòng)脈，以10 ml冰鹽水灌洗心臟，并于頭臂干分支處切斷主動(dòng)脈。集束結(jié)扎心臟周圍剩余脈管。取下供心并置于4℃冰鹽水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 受體手術(shù) 受鼠麻醉后固定于鼠板。術(shù)區(qū)剃毛、消毒后，經(jīng)腹正中切口進(jìn)入腹腔。向右上推開(kāi)腸管,并用濕鹽水紗布覆蓋，充分顯露腎動(dòng)靜脈至髂血管水平的下腔靜脈及腹主動(dòng)脈。血管夾同時(shí)阻斷下腔靜脈及腹主動(dòng)脈，分別于腹主動(dòng)脈及下腔靜脈做縱行切口，切口長(zhǎng)度與供心主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈寬度一致，采用兩點(diǎn)固定，連續(xù)縫合。吻合完畢后,緩慢松開(kāi)血管夾，棉簽輕觸心臟，促進(jìn)供心復(fù)跳。關(guān)閉腹腔，腹部切口絲線連續(xù)縫合，受鼠置于燈下保溫至蘇醒。術(shù)后不限食水。

1.3.3 移植心功能監(jiān)測(cè) 術(shù)后第3天開(kāi)始行腹部移植心觸診，根據(jù)移植心跳動(dòng)由強(qiáng)到弱分為4-0級(jí)，每日記錄，以指尖不能觸及移植心跳動(dòng)作為移植心排斥的時(shí)間。

1.3.4 小鼠尾-背皮膚移植方法 切取供鼠尾巴，縱行剖開(kāi)，取尾部全層皮膚，制備成大小約1×1 cm2的皮片備用。麻醉后受鼠背部剃毛，并剪掉與備用皮片相等大小的背部全層皮膚，5-0絲線四角固定移植皮片，油紗布覆蓋皮片，邦迪創(chuàng)可貼將油紗布固定。3天后拆除創(chuàng)可貼，觀察移植皮片存活情況，皮膚移植物排斥早期會(huì)在移植皮片上出現(xiàn)潰瘍、壞死，部分融合成片，隨后壞死的部分皮膚出現(xiàn)干燥、結(jié)痂，當(dāng)殘存正常的移植皮片小于原皮片的20%時(shí)判定為排斥。

1.3.5 小鼠皮膚心臟聯(lián)合移植方法 受鼠先行尾-背皮膚移植，隨后翻身即刻行腹部異位心臟移植，具體方法同前描述。

2 結(jié)果

2.1 一般手術(shù)情況

本研究單純皮膚移植組共行皮膚移植20例，術(shù)后1例因小鼠自身撕咬導(dǎo)致移植物脫落，手術(shù)成功率為95%(19/20)，手術(shù)時(shí)間為5.15±0.27 min；單純心臟移植組共行手術(shù)20例，其中1例術(shù)中復(fù)跳不佳，1例出現(xiàn)吻合口出血，手術(shù)成功率為90%(18/20)，手術(shù)時(shí)間為57.60±1.38 min；皮膚心臟聯(lián)合移植組共完成手術(shù)20例，其中1例術(shù)中出現(xiàn)心臟移植物吻合口出血，1例出現(xiàn)麻醉意外，手術(shù)成功率為90%(18/20)，手術(shù)時(shí)間為62.10±1.66 min，與單純心臟移植組比較，兩組手術(shù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 皮膚移植物存活情況

單純皮膚移植組皮膚移植物MST為7天，而皮膚心臟聯(lián)合移植組皮膚移植物中位存活時(shí)間略有延長(zhǎng)(MST=8天)，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1)。

圖1 小鼠皮膚移植物存活曲線

2.3 心臟移植物存活情況

單純心臟移植組和皮膚心臟聯(lián)合移植組手術(shù)成功36例，術(shù)后5天開(kāi)始兩組心臟移植物均出現(xiàn)不同程度的搏動(dòng)減弱，移植心體積增大，兩組心臟移植物MST均為9天(見(jiàn)圖2)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖2 小鼠心臟移植物存活曲線

2.4 移植物病理結(jié)果

皮膚移植物排斥期間均可見(jiàn)移植皮片壞死、潰瘍、結(jié)痂，HE染色顯示殘存的皮膚移植物組織層次及附屬物結(jié)構(gòu)不清，局部可見(jiàn)片狀壞死及大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖3)。

圖3 皮膚移植物HE染色結(jié)果

心臟移植物行H&E染色，觀察移植心內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況?？梢?jiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)水腫，心臟移植物內(nèi)可見(jiàn)大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖4)。

圖4 心臟移植物HE染色結(jié)果

3 討論

皮膚移植物中含有的蘭格漢斯細(xì)胞，是一種抗原提呈能力很強(qiáng)的樹(shù)突狀細(xì)胞，能將抗原迅速提呈給受體效應(yīng)性T細(xì)胞，主要通過(guò)Ⅰ類抗原提呈途徑介導(dǎo)快速的皮膚移植物排斥反應(yīng)，與其他血管化的大器官移植相比，小鼠皮膚移植發(fā)生的排斥反應(yīng)更加快速而猛烈，因此，皮膚移植也是各類同種異體器官或組織移植中最難成功的。但皮膚移植操作相對(duì)簡(jiǎn)單，移植物存活觀察方便，所以在移植免疫的實(shí)驗(yàn)研究中常用做首選的觀察方法[4]。皮膚移植的方法很多，傳統(tǒng)的背-背皮膚移植法需要將皮下組織去除，皮片處理花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)；耳-背皮膚移植法操作簡(jiǎn)單，但皮片較小，數(shù)量有限。本研究采用的是尾-背皮膚移植法，一個(gè)供體尾部皮膚取材后可以給5個(gè)受體行皮膚移植，而且采用四角固定，邦迪創(chuàng)可貼覆蓋，大大減少了由于受鼠自身撕咬造成的移植物脫落，本研究中皮膚移植40例，僅1例出現(xiàn)上述情況，成功率高，手術(shù)時(shí)間僅5分鐘左右，速度快，效果滿意。

而小鼠異位心臟移植屬于血管化器官移植，更貼近臨床器官移植，且主要通過(guò)Ⅱ類抗原提呈途徑將移植物抗原提呈給受者效應(yīng)性T細(xì)胞，現(xiàn)已被越來(lái)越多的應(yīng)用于移植免疫的實(shí)驗(yàn)研究。以往由于設(shè)備、器械和技術(shù)條件所限，心臟移植模型更多采用頸部血管套管心臟移植，即使用自制套管將受鼠頸部血管與供心血管連接[5]，雖然無(wú)需外科精密的血管吻合技術(shù)，但由于頸部空間相對(duì)較小，且需使用套管，容易形成血栓，套管與連接處易折曲，影響供心血供，移植心觸診困難，這些都可以對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，因此,目前國(guó)外大多推薦采用腹部異位移植模型[6]。本研究采用的為腹部異位心臟移植模型，40例心臟移植中僅3例出現(xiàn)外科情況導(dǎo)致失敗，相比國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究，成功率高。

本研究還首次建立了皮膚心臟聯(lián)合移植模型，皮膚心臟聯(lián)合移植組與單純心臟移植組的手術(shù)時(shí)間無(wú)明顯差別，說(shuō)明聯(lián)合移植并沒(méi)有增加移植的技術(shù)難度，并沒(méi)有顯著延長(zhǎng)術(shù)者的操作時(shí)間。皮膚心臟聯(lián)合移植組皮膚移植物排斥時(shí)間與單純皮膚移植組比較略有延長(zhǎng)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明移植物排斥可能與移植物的大小、體積有關(guān)[7]，聯(lián)合移植組不僅要排斥皮膚移植物，還要排斥同源的心臟移植物，所需要的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量巨大，所以造成效應(yīng)細(xì)胞的相對(duì)不足，皮膚移植物排斥時(shí)間略延長(zhǎng)。移植物病理提示出顯著的皮膚及心臟移植物排斥反應(yīng)，說(shuō)明此聯(lián)合移植模型完全適用于移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測(cè)和相關(guān)研究。

因?yàn)槠つw移植和心臟移植抗原提呈的途徑不盡相同，免疫反應(yīng)的機(jī)理不同，可能對(duì)移植物的排斥反應(yīng)、免疫耐受的誘導(dǎo)造成影響，而本研究中皮膚心臟聯(lián)合移植模型的建立，為移植免疫學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究建立了一個(gè)全新的模型，為研究者提供了一個(gè)新的選擇，且技術(shù)難度不大，成功率高，移植物排斥反應(yīng)監(jiān)測(cè)簡(jiǎn)便，結(jié)果確切，值得推廣。

[1]Corry RJ，Winn HJ，Russel PS．Primarily vaseularized allografts of hearts in mice．The role of H-2D．H-2K，and non-H-2 antigens in rejection[J]．Transplantation，1973，16(4)：343.

[2]Billingham RE,Medawar PB.The Technique of Free Skin Grafting in Mammals[J].J Exp Biol,1951,28:385.

[3]樊擁軍，張鳳蘊(yùn)，張 飚，等.一種簡(jiǎn)單的小鼠皮膚移植方法[J]．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,34(5)：332.

[4]成 功，陳 明，孫則禹，等.建立小鼠皮膚移植排斥模型穩(wěn)定獲得記憶T細(xì)胞[J]．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(4):32.

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[6]Demir Y,Chen Y,Metz C,et al.Cardiac allograft rejection in the absence of macrophage migration inhibitory factor[J].Transplantation,2003,76(1):244.

[7]Ulusal BG,Ulusal AE,Wei FC，et al.Allograft mass as a possible contributing factor to the skin transplant outcome[J].J Surg Res,2010,161(2):321.

Skin Plus Heart Transplantation In Mice And Graft Monitoring

HUYu,WUDa-wei,ZHAIXiu-yu,etal.

(DepartmentofPathology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To explore the technique of mouse skin plus heart transplantation and the function of graft monitoring.Methods Methods:BALB/C and C57BL/6 mice were used as donors and recipients,respectively.Skin only group:C57BL/6 recipients

tail skin from BALB/C donors.Heart only group:C57BL/6 recipients received heart grafts from BALB/C donors.Skin plus heart group:C57BL/6 recipients received heart and tail skin grafts from BALB/C donors at the same time.Heterotopic palpation was performed to monitor the function of heart graft after transplantation,the function of skin grafts were monitored by observing the size of surviving grafts.Results Median survival time (MST) of skin grafts in skin only group was 7 days,the skin grafts survival time have slightly longer compared to skin only group,but there were no significant difference(MST=8 days,P=0.1290).There were no significant difference of heart grafts survival time in both heats only group and skin plus heart group(MST=9 days,P=0.6077).Conclusion Skin plus heart transplantation procedure is stable to perform.Heterotopic palpation of hearts grafts and observing the size of skin grafts are simple to monitor the function of grafts.The skin plus heart transplantation model by using this procedure and monitoring protocol is useful for immunological research related to transplantation.

Transplantation;model;mouse

國(guó)家自然科學(xué)基金(81671574)

1007-4287(2017)07-1256-04

R654.2

A

胡鈺，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。

2017-03-20)

*通訊作者