張國躍?劉春河

[摘要] 目的 建立RP-HPLC法測定肝康寧片中虎杖苷含量的方法。 方法 采用Kromasil C18色譜柱（5?m，4.6mm×250mm）；甲醇-0.005mol/L乙酸銨溶液（28∶72）為流動相，流速1.0mL/min；柱溫35℃，檢測波長306nm。 結(jié)果 虎杖苷進(jìn)樣量在0.02824～0.4236μg之間，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，加樣回收率平均為97.51%，RSD=1.83%。 結(jié)論 本法結(jié)果簡便可行、準(zhǔn)確度高，適用于當(dāng)肝康寧片中虎杖苷的含量測定。

[關(guān)鍵詞] RP-HPLC法；肝康寧片；虎杖苷；虎杖

[中圖分類號] R286 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）09-39-03

Content of polydatin in liver corelle tablet determined by RP-HPLC

ZHANG Guoyue1 LIU Chunhe2

1.Shanxi Institute for Food and Drug Control， Xi'an 710065， China； 2.Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science & Technology， Wuhan 430064， China

[Abstract] Objective To establishi the method to determine the content of Polydatin in Liver Corelle tablet by RP-HPLC. Methods Kromasil C18 chromatographic column （5?m， 4.6mm×250mm） was used. Methanol-0.005mol/L and ammonium acetate solution （28∶72） was the mobile phase， and the current speed was 1.0Ml/min.The column temperature was 35℃. Detection wavelength was 306nm. Results Sample size of Polydatin was within 0.02824μg-0.4236μg， which showed good linear relationship with peak area， r=0.9999. Average recovery rate was 97.51%， RSD=1.83%. Conclusion This method is simple， feasible and accurate. It is suitable for the determination of polydatin in Corelle tablets.

[Key words] RP-HPLC method； Liver corelle tablet； Polydatin； Polygonum cuspidatum

肝康寧片是由白花蛇舌草、虎杖、垂盆草、柴胡、 人參、白術(shù)、等十二味藥味制成的薄膜衣片，具有清熱解毒，活血疏肝，健脾祛濕的功效，常用于急慢性肝炎，濕熱疫毒蘊結(jié)、肝郁脾虛證候的輔助治療。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[WS-10127（ZD-0127）-2012-2012Z]中，含量測定項僅測定虎杖中的蒽醌類成分大黃素，沒有二苯乙烯類的含量測定，不能有效的控制該制劑中虎杖所含有的二苯乙烯類成分含量，而二苯乙烯類的藥理活性與該藥物的治療目的密切相關(guān)，此類成分的抗炎等作用對于該藥物的治療效果起著相當(dāng)大的作用[1-2]，故測定該藥物中二苯乙烯類的代表成分虎杖苷顯得尤為重要，原標(biāo)準(zhǔn)亟待完善。受陜西步長高新制藥有限公司的委托，按照國家藥典委員會關(guān)于藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)要求，研究建立了用RP-HPLC法測定肝康寧片中虎杖苷含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。該方法操作簡便、快捷，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可很好地監(jiān)控該產(chǎn)品中虎杖苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫高效液相色譜儀、Waters Waters 2695/ 2487/ 2669高效液相色譜儀（紫外和二極管陣列檢測器），Waters Empower工作站；月旭 C18色譜柱（5?m，4.6mm×250mm）；賽多利斯AGME235S電子分析天平；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 其他

虎杖苷對照品（批號：111575-200502）由中國食品藥品檢定研究院提供。試劑均為分析純，水（超純水），甲醇（色譜純）?！案慰祵幤?、不含虎杖的陰性樣品均由委托方制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（5?m，4.6mm×250mm）；甲醇-0.005mol/L乙酸銨溶液（28∶72）為流動相，流速1.0mL/min；柱溫35℃，測定波長306nm。

2.2 對照品溶液的制備

取虎杖苷對照品7.51mg，加稀乙醇溶解并定容至100mL量瓶中，再用稀乙醇稀釋成每1mL含15.02μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取肝康寧片，研細(xì)，精密稱取約0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加稀乙醇25mL，稱定重量，85℃水浴回流45min，冷卻，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗

取不含虎杖的陰性樣品，按上述2.3供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液，將對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，測定，結(jié)果未見對虎杖苷測定的干擾。見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

將虎杖苷對照品溶液（濃度0.1412mg/mL）適量，稀釋成濃度為2.824、5.648、14.12、28.24和56.48μg/mL的溶液，照文中的色譜條件測定，進(jìn)樣量均為10μL，虎杖苷質(zhì)量（X）作為橫坐標(biāo)，虎杖苷峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，線性回歸結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.02824～0.5648μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=40119X+710.41（r=0.9999），見圖2。

2.6 儀器精密度考察

取虎杖苷對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣7次，峰面積的RSD=0.28%，表明精密度良好。

2.7 精密度

2.7.1 樣品重復(fù)性考察 取6份同一樣品，照上文中的方法制備試樣，測定，結(jié)果虎杖苷平均含量為1.97mg/g，RSD=1.39%。見表1。

2.7.2 中間精密度考察 取同一批樣品，由本實驗室的其他實驗員按照上文中的試驗方法，在不同時間使用另一臺高效液相色譜儀測定樣品中的虎杖苷含量，與與本文作者測定結(jié)果進(jìn)行比較，RSD=2.02%。

2.8 供試液穩(wěn)定性考察

取同一份樣品，照文中的方法制備試樣，分別在0、1、4、7、14、19、28h測定，結(jié)果RSD=1.65%，表明供試液在28h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.9 準(zhǔn)確度考察

精密稱取樣品約0.25g共6份，精密加入濃度為0.531mg/mL虎杖苷對照品溶液1mL，揮干溶劑，照上文中的方法制成供試液，測定，結(jié)果平均回收率為97.51%，RDS=1.83%。見表2。

2.10 峰純度檢測

取樣品溶液和對照品溶液，分別進(jìn)樣10μL，用二極管陣列檢測器，在200～500nm波長范圍掃描PDA光譜，結(jié)果，樣品PDA光譜與對照品PDA光譜一致，同時考察樣品峰純度，結(jié)果供試品溶液色譜峰純度符合要求。

3 討論

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根，主要成分有蒽醌類、二苯乙烯類、酚類和黃酮類等，具有祛風(fēng)利濕、祛痰止咳、清熱解毒、活血化瘀等功效，近年來虎杖的研究較多，藥理學(xué)研究顯示，虎杖具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、肝保護(hù)、抗菌抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、提高免

疫力等多種藥理活性[2-7]，其中的二苯乙烯類和蒽醌類成分如虎杖苷、大黃素等是其主要活性成分，現(xiàn)行的《中國藥典》（2015年版一部）含量測定標(biāo)的物就是虎杖苷和大黃素 [8]，虎杖苷可在生物體內(nèi)脫去糖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，而白藜蘆醇是近年來植物抗毒素研究的熱點，安梅等[9]從白藜蘆醇的來源、一般特性、生物合成、體內(nèi)代謝和藥理活性等方面綜述了白藜蘆醇抗腫瘤作用及機制的研究進(jìn)展和抗氧化、抗炎等效應(yīng)的研究近況，認(rèn)為白藜蘆醇作為多種中藥治療炎癥、脂類代謝和心臟疾病等的有效成分，其作用于心血管系統(tǒng)疾病、抗腫瘤和抗炎作用等的臨床研究和基礎(chǔ)研究也在不斷深入，白藜蘆醇的藥理學(xué)作用正日益得到重視，有望成為防治相關(guān)疾病的新型藥物，其臨床應(yīng)用前景將更加廣闊。

截止目前，尚未有測定肝康寧片中虎杖苷含量的報道，根據(jù)肝康寧片的處方和制備工藝，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]，分別以80%的甲醇、甲醇及乙醇、稀乙醇作為提取溶劑，分別加熱回流45min，結(jié)果以稀乙醇為溶劑制備的供試品溶液虎杖苷的含量最高；再以稀乙醇為提取溶劑，分別用30、60、90min的處理時間和超聲處理、加熱回流處理方式來制備供試品溶液，結(jié)果文中的制備方法較好，延長處理時間，虎杖苷的含量沒有明顯增加。曾試驗過乙腈-水、乙腈-水-0.2%磷酸溶液等流動相系統(tǒng)， 結(jié)果與本文中流動相條件下差異不大，從經(jīng)濟和安全角度考慮，確定了本文中的流動相。還通過改變流速、柱溫和改用其他品牌色譜柱分別運行供試品溶液，結(jié)果樣品色譜峰的峰型、面積等無明顯變化。鑒于虎杖苷的光穩(wěn)定性不太好，整個試驗過程應(yīng)注意避光操作[15]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 時圣明， 潘明佳， 王文倩，等.虎杖的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].藥物評價研究，2016，39（2）：317-321.

[2] 樊慧婷，丁世蘭，林洪生.中藥虎杖的藥理研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志，2013，38（15）：2545-2547.

[3] 張文婷，黃琴偉，向智敏，等.大鼠腸道菌對虎杖苷的生物轉(zhuǎn)化研究[J]. 中國藥學(xué)雜志，2012，47（8）：631-634.

[4] 馮磊，張蓮芬，嚴(yán)婷，等.中藥虎杖中抗癌活性物質(zhì)研究[J].中藥材，2006，29（7） ： 689-691.

[5] 賈玉梅，王君明，崔瑛. 基于二苯乙烯類為主要活性成分的虎杖藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（ 9）： 263-269.

[6] 高守紅， 楊少麟， 范國榮.虎杖苷的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實踐雜志，2005，23（3）：145-147.

[7] 葉肖栗，宋莉，任國飛，等.HPLC-MS法測定虎杖活性成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)[J]. 藥物分析雜志，2013，33（5）：749-754.

[8] 國家藥典委員會.中國藥典2015年版：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科學(xué)出版社，2015：208-209.

[9] 安梅，周瑾，陳曉宇.白藜蘆醇藥理學(xué)作用的研究進(jìn)展[J].腫瘤藥學(xué)，2014，4（4）：242-246.

[10] 馬培，許利嘉，劉延澤，等. 虎杖藥材UPLC 特征圖譜研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（2）：72-76.

[11] 范玲，嚴(yán)冬，李爽，等. 一測多評法測定虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素及大黃素甲醚的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，19（7）：103-107.

[12] 趙玲玲. 高效液相色譜法測定虎梅含片中虎杖苷的含量[J]. 安徽醫(yī)藥雜志，2016，10（5）：341-342.

[13] 謝健鳴，隆穎.HPLC法同時測定補正片中虎杖苷、補骨脂素及異補骨脂素的含量[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué)，2016，6（9）：32-35.

[14] 車彥忠，王培智.高效液相色譜法測定護(hù)肝寧膠囊中虎杖苷的含量[J]. 中醫(yī)臨床研究，2014，5（19）：27-28.

[15] 曹庸，于華忠，張敏，等. HPLC法測定虎杖白藜蘆醇的含量及其穩(wěn)定性研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004，24（2）：61-64.

（收稿日期：2017-03-16）