高 巖 徐凱智 陳 楠 文 翠 劉慶陽

華北理工大學 河北唐山 063000；①唐山工人醫(yī)院麻醉科;②煤炭總醫(yī)院

體外條件下地塞米松和骨髓細胞對肺組織細胞的影響

高 巖 徐凱智①陳 楠 文 翠 劉慶陽②

華北理工大學 河北唐山 063000；①唐山工人醫(yī)院麻醉科;②煤炭總醫(yī)院

①目的 研究在體外條件下地塞米松及骨髓細胞對肺組織細胞的影響。②方法 取小鼠肺組織細胞體外培養(yǎng)，通過脂多糖(LPS,10μg/mL)刺激建立肺組織損傷模型，給予骨髓細胞(5×106)及經(jīng)過不同濃度地塞米松(2ng/mL，4ng/mL，10ng/mL，1μg/mL)處理的骨髓細胞(5×106)進行處理，5天后檢測各組細胞的形態(tài)及凋亡情況。再通過LPS滴鼻制作急性肺損傷小鼠模型(50μg/只)，再分別給予回輸生理鹽水、地塞米松、熒光骨髓細胞、地塞米松和熒光骨髓細胞，比較各組死亡率。③結(jié)果 與單純肺組織細胞組相比，其他各實驗組細胞的形態(tài)均較好，凋亡率均較低，其中同時給予地塞米松2ng/mL處理的骨髓細胞實驗組的細胞數(shù)量最多，形態(tài)最好，凋亡率最低(P<0.05)；給予地塞米松和熒光骨髓細胞處理的實驗組小鼠死亡率最低(P=0.034)。 ④結(jié)論 在體外培養(yǎng)條件下，地塞米松2ng/mL可以加強骨髓細胞對損傷肺組織的保護作用，維持肺組織細胞的形態(tài)，降低肺組織細胞的凋亡。

體外條件 地塞米松 熒光骨髓細胞 肺組織細胞 凋亡

目前研究認為，膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，多由細菌、病毒、真菌、支原體、寄生蟲感染引起。其中細菌感染占絕大多數(shù)，以凝固酶陰性的葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、肺炎克雷伯桿菌多見[1]。膿毒癥病情十分兇險，死亡率非常高。肺臟是最易受到膿毒癥影響的靶器官之一，機體發(fā)生膿毒癥時，一旦并發(fā)急性肺損傷(ALI)，患者的死亡率將會大大增加。地塞米松是臨床的常用藥物，應(yīng)用一定劑量具有很好的抗炎作用[2]。骨髓中除了造血干細胞外，還有間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，將BMSCs移植到損傷的肺組織可以起到保護肺組織的作用[3,4]。為探討地塞米松是否可以通過激活骨髓細胞加強對脂多糖(LPS)損傷的肺組織的保護作用，本實驗選取正常C57BL-6小鼠肺組織細胞作為研究材料，以LPS 10μg/mL炎癥反應(yīng)為模型，探討地塞米松及骨髓細胞對LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織細胞的影響，從而證明地塞米松對骨髓細胞保護肺組織有較強的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性C57BL-6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±1)克，清潔級，購自于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-0004。動物房采用12小時光照，溫度控制在(25±2)℃，相對濕度為40%～65%。實驗小鼠先飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，然后進行正式實驗。本實驗已經(jīng)獲得國家倫理委員會的批準，并依據(jù)國家對實驗動物管理的相關(guān)規(guī)定進行操作。

1.2 實驗藥物和試劑 脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；DMEM-高糖(4.5g/L)培養(yǎng)基(Hyclone 公司)；胎牛血清(FBS)和含EDTA胰蛋白酶(中國北京索來寶生物科技有限公司)；7-AAD(美國ebioscience公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司，國藥準字H22022889) 。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠肺組織細胞及熒光骨髓細胞的獲取 取正常健康的C57BL-6小鼠，頸椎脫臼法處死后放入酒精中消毒5分鐘，消毒后放在無菌超凈臺上解剖取出肺組織，在無菌條件下進行研磨，離心，重懸，計數(shù)；再取正常的熒光小鼠，頸椎脫臼法處死后放入酒精中消毒5分鐘，然后在無菌超凈臺上取四肢長骨，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖出管腔內(nèi)的骨髓，離心，重懸，計數(shù)。

1.3.2 實驗分組及干預(yù) 將取得的正常熒光小鼠的骨髓細胞分成5組，分別放入無菌離心管中，標記為A、B、C、D、E， 每組熒光骨髓細胞5×106，在A、B、C、D組中分別加入不同濃度地塞米松(2ng/mL，4ng/mL，10ng/mL和1μg/mL，E組不加地塞米松，各組加細胞完全培養(yǎng)基至1mL。細胞完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM(-)高糖培養(yǎng)基(含4.5g/L葡萄糖)，加入青鏈霉素混合液(青霉素的工作濃度為100U/mL，鏈霉素的工作濃度為0.1g/L)，然后將各管細胞放入溫度為37℃，CO2濃度為5%的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

將取得的正常C57BL-6小鼠的肺組織細胞分成6組，分別放入無菌離心管中，標記為a、b、c、d、e、f，每組肺組織細胞5×106，然后加入LPS，使離心管內(nèi)LPS的濃度是10μg/mL。各組加細胞完全培養(yǎng)基至1mL。然后將各管細胞放入溫度為37℃，CO2濃度為5%的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

24小時后分別取出培養(yǎng)的骨髓細胞和LPS處理的肺組織細胞，離心，重懸。將在無菌條件下離心重懸取得的經(jīng)LPS處理的C57BL-6小鼠的肺組織細胞分別放入各個培養(yǎng)瓶，共6個，標記為a、b、c、d、e、f，將離心得到的熒光骨髓細胞按對應(yīng)的字母分別加入其中的5個培養(yǎng)瓶中，f瓶內(nèi)只加肺組織細胞，作為對照組。每組加細胞完全培養(yǎng)基至5mL。將各個培養(yǎng)瓶放入溫度為37℃，CO2濃度為5%的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。

1.3.3 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況 取出在CO2培養(yǎng)箱孵育5天后的細胞，置于倒置熒光顯微鏡下，觀察細胞的數(shù)量及形態(tài)，并照相。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 取出在CO2培養(yǎng)箱孵育5天后的細胞，按7-AAD試劑說明書要求，分別收集各培養(yǎng)瓶中的細胞，用PBS漂洗2次，加入一定量緩沖液，使細胞濃度為106個/mL，取100μL細胞懸液于流式管中，加入檢測中性粒細胞和單核巨噬細胞的抗體30分鐘后加入7-AAD 試劑2μL，混勻，于4℃避光靜置30分鐘后采用流式細胞儀(BD Calibur，美國BD公司)檢測細胞凋亡的百分率，認定7-AAD陽性為凋亡細胞，試驗重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 死亡率的觀察 取正常C57BL-6小鼠80只，分成4組，每組20只，分別標記為a、b、c、d 4組，均體外滴鼻LPS 50μg/只,制作成ALI模型，其中a組回輸生理鹽水1mL；b組回輸?shù)厝姿?mg/只,共1mL；c組回輸熒光骨髓細胞107，共1mL；d組回輸?shù)厝姿?3mg/只)和熒光骨髓細胞107，共1mL。48小時后觀察各組小鼠的死亡數(shù)目及生存狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況 經(jīng)過處理的細胞培養(yǎng)5天后，即可看見細胞的數(shù)量及形態(tài)均發(fā)生改變，如圖1所示。通過對比，在10倍鏡視野下可以發(fā)現(xiàn)各個實驗組與f組相比，數(shù)量都多，并且a組細胞數(shù)量最多，并且視野內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)組織團塊，這說明可能有肺組織細胞在生長分化。而其他實驗組細胞數(shù)量基本相同，并且沒有發(fā)現(xiàn)組織團塊。在40倍鏡視野下可以發(fā)現(xiàn)各個實驗組與f組相比，細胞形態(tài)均較好，細胞碎片都比f組少，其中a組細胞形態(tài)最完好，大多數(shù)細胞呈橢圓形，細胞碎片較少。而其他實驗組之間差異不大。

注：f單純肺組織組，e單加骨髓細胞組，a 2ng地塞米松處理的骨髓細胞組，b 4ng地塞米松處理的骨髓細胞組，c 10ng地塞米松處理的骨髓細胞組，d 1μg地塞米松處理的骨髓細胞組

圖1 倒置相差顯微鏡下各組細胞成像

2.2 地塞米松及骨髓細胞對LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測的結(jié)果如圖2所示，與f組相比，其他各組均有不同程度的細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過對比，a組細胞凋亡率較f組最低，e組也比f組凋亡率低。而b、c、d組凋亡率較f、e和a組有所上升，并且隨著地塞米松濃度的增加而增加。

圖2 小鼠肺組織細胞凋亡的流式分析

2.3 地塞米松及骨髓細胞對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠死亡率的影響

表1 小鼠的生存數(shù)與死亡數(shù)(只)

注：A、B、C、D不同處理組之間通過列聯(lián)表卡方檢驗得到，P=0.034;A組回輸生理鹽水1mL，B組回輸?shù)厝姿?mg/只,共1mL,C組回輸熒光骨髓細胞107，共1mL D組回輸?shù)厝姿?mg/只和熒光骨髓細胞(107)，共1mL。

D組小鼠死亡數(shù)量最少，C組和B組分別位于第二和第三，而A組死亡數(shù)最高，并且通過列聯(lián)表χ2檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

膿毒癥是一種發(fā)展不可控的全身炎癥反應(yīng)綜合征，多繼發(fā)于嚴重感染、大面積燒傷、創(chuàng)傷及大手術(shù)嚴重應(yīng)激等。膿毒癥發(fā)病機制十分復(fù)雜，同時又有多種信號傳導(dǎo)途徑參與其中[5]。在膿毒癥早期，病原微生物，主要是細菌內(nèi)毒素和LPS與LPS結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，然后再與單核、巨噬細胞表面的Toll樣受體(TLR)結(jié)合，啟動細胞內(nèi)信號傳輸系統(tǒng)，促使這些細胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì)，如PGs、C3a、C5a[6]，最終導(dǎo)致臟器細胞凋亡。膿毒癥時，全身炎癥反應(yīng)可使機體產(chǎn)生較多的氧自由基、血管緊張素-Ⅱ，這些氧自由基和血管緊張素-Ⅱ可使機體血流動力學發(fā)生改變，使內(nèi)皮細胞損傷[7]，進而引起內(nèi)皮細胞的凋亡。機體發(fā)生膿毒癥后，微循環(huán)的核心變化之一是血管通透性增加及內(nèi)皮細胞屏障功能喪失，從而導(dǎo)致機體組織水腫和循環(huán)物質(zhì)移位[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥常常可以引起肺損傷，這種ALI以彌漫性肺細胞損傷為病理生理基礎(chǔ)[9]，可導(dǎo)致肺血管損傷，從而引起肺水腫和肺組織炎性細胞浸潤[10]。而肺損傷又會促進膿毒癥的進展和惡化。所以，如果能夠及時發(fā)現(xiàn)并有效治療膿毒癥引起的ALI，就能夠有效的改善膿毒癥的預(yù)后和降低膿毒癥的死亡率。

地塞米松是臨床上的一種常用糖皮質(zhì)激素，雖然目前認為ALI發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明[11]，但是糖皮質(zhì)激素治療ALI已有近50年的歷史，可以通過直接、間接作用抑制與炎癥反應(yīng)有關(guān)的炎性細胞及細胞因子，從而有效緩解ALI時的炎癥反應(yīng)，保護肺組織，降低肺組織細胞的凋亡率[12]。隨著對糖皮質(zhì)激素的廣泛研究和應(yīng)用，國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素治療ALI的主要機制是抗炎和抗纖維化[13]。研究表明，在體外間充質(zhì)干細胞可以分化為成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞，將骨髓間充質(zhì)干細胞移植后，可以被動員到肺組織損傷部位，并通過釋放可溶性因子，減輕肺毛細血管內(nèi)皮的通透性，減輕肺泡水腫，緩解肺部的炎癥反應(yīng)，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，幫助肺部血管重建，起到治療ALI的效果[4]。既然地塞米松和骨髓細胞都可以對ALI有一定的治療效果，那么它們的治療效果一定不是簡單的相加關(guān)系。

本實驗結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)，經(jīng)過LPS 10μg/mL誘導(dǎo)造成肺組織損傷模型的條件下，加入經(jīng)過地塞米松2ng/mL處理的熒光骨髓細胞實驗組其肺組織的細胞數(shù)量最多，形態(tài)最好，而不加地塞米松和骨髓細胞的對照組細胞數(shù)量最少，形態(tài)最差，而其它各實驗組雖然比對照組細胞數(shù)量多，形態(tài)好，但是它們之間的差異不明顯。通過檢測凋亡率發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過2ng/mL地塞米松處理的熒光骨髓細胞組的細胞凋亡率最低，單獨加入熒光骨髓細胞的實驗組也比對照組低。但是，地塞米松濃度超過2ng/mL的其他3個實驗組的凋亡率反而高于對照組(P<0.05)，說明經(jīng)過2ng/mL地塞米松處理的骨髓細胞對損傷肺組織細胞的保護作用有所增強，由此說明同時應(yīng)用地塞米松和骨髓細胞治療ALI時其療效并不是簡單的兩者治療效果的加和，而是出現(xiàn)了相互增強的結(jié)果。本實驗通過觀察小鼠的死亡率發(fā)現(xiàn)，同時給予地塞米松和骨髓細胞的實驗組其死亡率均低于其它各實驗組，而未給予藥物治療的對照組死亡率最高，說明地塞米松能夠加強骨髓細胞對損傷肺組織的保護。雖然在本實驗中地塞米松濃度為2ng/mL時細胞凋亡率最低，但是在4ng/mL時凋亡率卻超過了f組，說明在0ng/mL到4ng/mL的濃度范圍內(nèi)可能存在一個最適宜的濃度，使細胞凋亡率最低。

綜上所述，地塞米松可以加強骨髓細胞對損傷肺組織的保護作用，其可能機制除了藥物本身的治療效果外，還可能是地塞米松刺激了骨髓細胞的分化和遷移，加強了骨髓細胞對肺組織的保護作用，但其具體機制及最適宜的濃度還需要進一步的實驗研究。

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(2017-02-10 收稿)(庫雪飛 編輯)

Effects of dexamethasone and bone marrow cells on lung tissue cells in vitro

GAO Yan, XU Kaizhi,CHEN Nan,et al

(North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China)

Objective To study the effects of dexamethasone and bone marrow cells on lung tissue in vitro. Methods Mouse lung tissue cells were cultured in vitro, Bone marrow cells (5×106) treated with different concentrations of dexamethasone (2ng/mL, 4ng/mL, 10ng/mL, 1μg/mL) were treated with lipopolysaccharide (LPS,10μg/mL) to induce lung injury model. And the morphology and apoptosis of the cells were detected after 5 days. And then made LPS intranasal acute lung injury model (50μg/only). Then the rats were treated with normal saline,dexamethasone, fluorescent bone marrow cells, dexamethasone and fluorescent bone marrow cells. The mortality of each group was compared. Results Compared with the pure lung cell group,the other groups had good cell morphology,apoptosis rate was low,while dexamethasone treatment 2ng/mL number of bone marrow cells in the experimental group were the most and best form, and the apoptosis rate of the lowest (P<0.05); and at the same time,dexamethasone and fluorescence of bone marrow cells in the experimental group the lowest mortality (P=0.034). Conclusion In vitro culture,dexamethasone 2ng/mL can enhance the protective effect of bone marrow cells on damaged lung tissue,maintain the morphology of lung cells and reduce the apoptosis of lung tissue cells.

In vitro conditions.Dexamethasone.Fluorescent bone marrow cells.Lung tissue cells.Apoptosis

國家自然科學基金(編號：81272140)；中國博士后面上項目(編號：201150M1530)； 中國博士后第五批特別資助項目(編號：2012T50863)。

高 巖(1990-)，男，碩士研究生，醫(yī)師。研究方向：膿毒癥的基礎(chǔ)與臨床研究。

徐凱智,劉慶陽。

R 614.1

A

2095-2694(2017)04-263-05