陳 科, 李 凱, 周宇荀, 肖君華

(東華大學 a.環(huán)境科學與工程學院; b.生物科學與技術研究所, 上海 201620)

利用二代測序數(shù)據(jù)判定SNP基因型

陳 科a, 李 凱b, 周宇荀b, 肖君華b

(東華大學 a.環(huán)境科學與工程學院; b.生物科學與技術研究所, 上海 201620)

通過將二代測序數(shù)據(jù)與連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR)對單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism, SNP)基因分型的結果進行比對, 確定二代測序數(shù)據(jù)判定SNP基因型的經驗性閾值.利用多重聚合酶鏈式反應(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)對91個樣本進行19個SNP位點的擴增, 擴增的產物混勻純化后在Ion torrent PGM儀器上進行二代測序.利用LDR技術對相應的SNP位點進行檢測, 將其分型結果作為二代測序數(shù)據(jù)判定SNP基因型的標準, 確定了二代測序數(shù)據(jù)判定SNP基因型的閾值: 測序深度≥6X, 等位基因比率在15%～85%的位點為雜合子, 在范圍之外的為純合子, 該閾值準確度達到99.6%； 針對等位基因頻率分布在閾值邊緣的數(shù)據(jù), 結合聚類分析可將正確率提升至100%.研究結果為利用二代測序數(shù)據(jù)判定SNP基因型提供了一個準確、快捷和經驗性的閾值與方案．

單核苷酸多態(tài)性(SNP)；二代測序；多重聚合酶鏈式反應(multiplex PCR)

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是一種與復雜疾病相關的重要遺傳位標[1].通常利用SNP進行生物學分析, 如遺傳結構分析、個體化用藥和復雜疾病定位.在過去的30年, 新SNP的發(fā)現(xiàn)依賴于以聚合酶鏈式反應(PCR)和毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)為基礎的一代測序技術, 而SNP分型方案則依賴于Taqman、 Sequenom、SnaPshot、連接酶檢測反應(LDR)和基因芯片等技術[2].近10年來, 二代測序技術高速發(fā)展, 其通量的不斷提高以及成本的急劇下降, 使得二代測序技術開始成為SNP分型不可或缺的武器[3-4].

伴隨著重測序技術, 如雜交后測序[5]、微液滴PCR[6]、分子內探針[7]等技術的開發(fā), 將二代測序平臺結合重測序技術應用于SNP分型已成為二代測序應用的重要部分[8], 并逐漸取代傳統(tǒng)方案在SNP發(fā)現(xiàn)和分型上的作用[9-10].與此同時, Thermo Fisher Scientific和Illumina等供應商也開始提供商業(yè)化的試劑盒，以滿足研究人員同時針對上百個樣本和上百個目標區(qū)段內的SNP位點進行分型, 為二代測序技術進行大規(guī)模樣本SNP分型提供了可行性[11-12].

二代測序低廉的測序價格和超高的測序通量是進行SNP分型的巨大優(yōu)勢, 但是在海量數(shù)據(jù)面前, 如何準確地進行SNP分型, 將是一個巨大的挑戰(zhàn).利用二代測序數(shù)據(jù)進行SNP分型, 困難主要集中于兩個方面.一方面是等位基因偏差導致的困難.在二倍體個體中, 雜合子SNP位點的每條等位基因比率應該是50%, 但是在目標區(qū)段捕獲和文庫制備過程中, 因為捕獲效率和擴增效率差異, 導致每條等位基因比率偏離50%.因此, 對于低覆蓋度的測序(平均每個位點測序深度<5X), 會導致雜合子中只有其中一條等位基因被測序, 出現(xiàn)假陰性的情況.在這種情況下, 進行準確的SNP分型是非常困難的[13].雖然提高測序深度可以有效解決雜合子兩條等位基因測序丟失的問題, 但是過度提高測序深度仍然無法徹底解決SNP分型錯誤的問題[14].另一方面是測序錯誤導致的困難.在二倍體個體中, 純合子SNP位點的兩條等位基因的基因型是相同的, 但是由于測序錯誤會導致純合子的測序結果呈現(xiàn)出雜合子的可能性.隨著測序深度的提高, 假陰性的可能性急劇下降, 但是測序錯誤經過累加, 使得純合子判讀越來越困難, 假陽性的比例升高.同時, 針對大規(guī)模平行測序時, 增加測序深度會導致成本急劇增加.因此, 提出一個準確、適當?shù)腟NP分型閾值, 是利用二代測序對大規(guī)模樣本進行SNP分型時的重要補充.

本文利用多重PCR對91個樣本進行19個SNP位點的擴增, 將PCR產物混合純化后在Ion torrent PGM平臺上進行二代測序.同時利用PCR-LDR技術對上述所有對應位點進行SNP分型, 結合二代測序數(shù)據(jù)進行驗證, 以確定二代測序平臺針對SNP分型的經驗性閾值.以LDR分型結果為標準, 與二代測序數(shù)據(jù)進行對比, 提出一個準確、經驗、有效的二代測序數(shù)據(jù)進行SNP分型的閾值和方案.

1 材料與方法

1.1 DNA提取

91個人血樣，由無錫市精神衛(wèi)生中心提供.DNA提取采用AXYGEN(杭州愛思進生物技術有限公司, 中國)血基因組小量制備試劑盒, 操作步驟依說明書進行.以0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000c型超微量分光光度計 (Thermo Fisher Scientific, 美國)確定DNA質量和濃度.

1.2 引物的設計

19個SNP位點的rs號和基因序列信息來源于美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI).所有特異引物用Primer3在線軟件(http: //frodo.wi.mit.edu/primer3/)設計, 特異引物的解鏈溫度(tm)在55 ～65 ℃, GC含量在20%～80%.特異引物上游和下游分別添加通用接頭序列: 上游通用序列5’-tgtaaaacgacggccagt-3’；下游通用序列5’-caggaaacagctatgacc-3’(見表1).為標記不同樣本, 設計攜帶不同index序列的接頭引物以標記不同樣本, 91個樣本分別由不同的接頭引物標記.所有引物皆由上海翰宇生物科技有限公司合成.三輪PCR原理示意圖如圖1所示，特異引物包括兩個部分: 特異序列(白色)和通用序列(黑色)；接頭引物由3部分組成: Ion torrent接頭序列(灰色)、特異index序列(斜線)和通用序列(黑色).

1.3 三輪PCR

PCR產物均一性是評價多重PCR的重要指標, 利用三輪PCR技術保證每對引物均勻擴增.三輪PCR使用的特異引物濃度極低, 在反應中又進一步地稀釋特異引物濃度, 因此可以將低濃度特異引物盡可能地耗盡, 減少不同位點間的競爭, 以增加不同位點間均一性.與此同時, 用于文庫構建的每對接頭引物具有相同的擴增通用序列, 可以保證不同樣本擴增時PCR效率的一致性, 以增加不同樣本產物間的均一性.

表1 19個SNP位點引物

如圖1所示: 第一輪PCR, 添加低濃度特異引物擴增；第二輪PCR, 取部分第一輪PCR產物作為模板添加到第二輪PCR體系中, 不額外添加引物擴增, 盡可能將第一輪殘余引物消耗完；第三輪PCR, 直接將第三輪PCR體系添加到第二輪體系中, 利用接頭序列將所有PCR產物添加上測序接頭.經過三輪PCR后, PCR產物可以直接作為二代測序文庫.

圖1 三輪PCR原理示意圖Fig.1 The schematic diagram of three-round PCR

1.3.1 第一輪PCR

PCR反應體系(10 μL)包括4.0 μL雙蒸水, 1 μL 10×PCR Buffer(含100 mmol/L Mg2+), 0.8 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 2 μL混合特異引物 (每條特異引物0.25 μmol/L), 1 U Hot Start DNA 聚合酶(5 U/μL) 和 2 μL DNA 模板(25 ng/μL).PCR反應程序: 94 ℃變性15 min, 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸30 s, 20個循環(huán).

1.3.2 第二輪PCR

PCR反應終體系(10 μL)包括5 μL 雙蒸水, 3 μL 第一輪PCR產物作為模板, 1.0 μL 10×PCR Buffer(含100 mmol/L Mg2+), 0.8 μL dNTPs(2.5 mM), 1 U Hot Start DNA 聚合酶(5 U/μL).PCR反應程序: 94 ℃變性15 min, 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸30 s, 40個循環(huán).

1.3.3 第三輪PCR

第三輪PCR體系直接添加到第二輪反應體系中, 第三輪PCR反應體系(10 μL)包括7 μL 雙蒸水, 1.0 μL 10×PCR Buffer(含100 mmol/L Mg2+), 0.8 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 1 μL接頭引物上下游引物(5 μmol/L), 1 U Taq DNA 聚合酶(1 μL) .PCR反應程序: 94 ℃變性15 min, 94 ℃ 變性30 s, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸30 s, 15個循環(huán)；72 ℃補齊 10 min .

91個樣本的PCR產物等量混合在一起, 振蕩混勻.混勻的混合產物利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司, 中國)純化, 純化后的PCR產物可直接用于后續(xù)測序反應.

1.4 Ion torrent PGM測序

純化后的PCR產物于Ion torrent PGM測序儀(Thermo Fisher Scientific, 美國)上測序, 操作流程按照標準說明書進行.首先, 純化后的PCR產物在OneTouch 2儀器上進行乳液PCR擴增, 通過乳液PCR擴增將測序片段富集在微珠上；乳液PCR擴增后的微珠由OneTouch 2 ES富集.富集的微珠結合318芯片(Thermo Fisher Scientific, 美國)和Ion PGMTMSequencing 200 Kit v2測序試劑盒在Ion torrent PGM儀器上測序, 測序流程嚴格按照說明書進行.

1.5 LDR

針對91個樣本中19位點的LDR檢測由上海翼和應用生物技術有限公司完成.

1.6 數(shù)據(jù)分析

二代測序數(shù)據(jù)經過base calling的原始數(shù)據(jù)通常包含3個部分: index序列、接頭序列和特異序列.基于樣本index序列的差異, 利用FASTX-Toolkit軟件比對index序列, 根據(jù)index序列差異將原始數(shù)據(jù)中每個樣本的數(shù)據(jù)區(qū)分, 在比對index序列時最多允許一個堿基的錯配；匹配到每個樣本的數(shù)據(jù)利用Cutadapt軟件將接頭序列去掉.運用序列比對軟件BWA (v0.7.12)將去接頭后的序列與SNP位點參考序列(NCBI)比對, 統(tǒng)計每個位點等位基因的reads數(shù)目, 計算其等位基因比率.

針對二代測序數(shù)據(jù)分型, 以LDR分型結果為標準, 即將LDR基因分型結果直接作為二代測序數(shù)據(jù)分型的結果.在此基礎上, 將二代測序數(shù)據(jù)中位點的等位基因比率和LDR基因分型結果一一對應, 以確定二代測序數(shù)據(jù)中雜合子和純合子等位基因比率閾值.

2 結果與分析

2.1 二代測序結果

針對91個樣本, 對19個SNP位點進行SNP分型.以X代表擴增子的測序深度, 二代測序結果顯示, 1 721個擴增子被成功捕獲, 而且至少被測序一次(測序深度≥1X)；SNP位點的捕獲成功率為99.5%.擴增于測序深度分布圖如圖2所示.

圖2 擴增子測序深度分布圖Fig.2 Distribution of amplicons

由圖2可知，1 721個擴增子的平均測序深度為136X, 96.2%擴增子的測序深度>平均測序深度的0.2倍；同時擴增子的測序深度呈現(xiàn)集中分布的趨勢, 94.5%擴增子的測序深度集中在6X～300X (50倍差異).這種分布是利用二代測序技術對大規(guī)模樣本進行SNP分型時測序深度分布的理想模型.該分布模型不僅保證了大多數(shù)擴增子有足夠的測序深度, 同時避免了過多的高測序深度擴增子占用測序通量, 有效地節(jié)省了測序成本.在此測序深度分布模型的基礎上, 結合LDR分型結果, 為二代測序數(shù)據(jù)進行大規(guī)模樣本SNP分型提供一個準確的閾值和方案.

2.2 擴增子等位基因比率

二代測序數(shù)據(jù)顯示有1 721個擴增子被成功測序, 將成功測序的擴增子等位基因比率進行統(tǒng)計.LDR分型結果顯示，上述1 721個擴增子中雜合子為612個(35.6%)和純合子為1 109個(64.4%).基于LDR技術的準確性[2], 將LDR的基因分型結果作為標準結果賦予二代測序數(shù)據(jù): 利用二代測序數(shù)據(jù)中1 721個擴增子計算等位基因比率, 并直接選取LDR的分型結果, 為二代測序判定SNP基因型提供一個準確的閾值.擴增子等位基因比率如圖3所示，以LDR技術對1 721個擴增子的分型結果為基礎, 結合二代測序數(shù)據(jù)中對應擴增子等位基因的測序深度比值作圖, 612個雜合子中, 610個(99.6%)雜合子等位基因比率在15%～85%.1 109個純合子中, 1 105個(99.6%)純合子等位基因比例在15%～85%之外.因此, 可以選取15%～85%作為判斷雜合子和純合子的閾值.

圖3 擴增子等位基因比率Fig.3 Allelic ratio of amplicons

SNP位點等位基因比率分布如圖4所示.由圖4可知，94.5%的純合子等位基因比率分布在98.0%～100%之外；89.0%的雜合子等位基因比率分布在40%～60%.雜合子等位基因比率隨著測序深度的增加, 逐漸接近理想值50%, 說明隨著測序深度的提升, 雜合子的分型越來越來越容易(見圖3).與之相對的是純合子分型, 純合子的等位基因頻率不隨測序深度變化而轉變, 說明對于低測序深度, 純合子的判讀更容易.

圖4 SNP位點等位基因比率分布Fig.4 The allelic ratio distribution of amplicons

雜合子等位基因比率在15%～85%之外的2個數(shù)據(jù)中, 其中一個數(shù)據(jù)(rs140489)測序深度為2X, 偏差原因可能是測序深度過低, 導致等位基因只有一條被成功測序, 導致等位基因缺失[14]；另外一個數(shù)據(jù)(rs3739470)測序深度為47X, 等位基因比率為14.9%, 該位點等位基因比率接近15%～85%閾值.類似的結果也發(fā)生在1 109個純合子中, 純合子等位基因偏差的4個數(shù)據(jù)中, 2個數(shù)據(jù)(rs140489和rs4842131)測序深度為5X, 偏差原因可能是測序深度過低, 隨機測序錯誤引入導致等位基因比率變化過大；另外兩個數(shù)據(jù)(rs5754217和rs3093024)的測序深度分別為46X和160X, 等位基因比率分別是83.7%和84.4%, 接近15%～85%閾值之外. 上述結果表明, 針對二代測序數(shù)據(jù)判定SNP基因型選取15%～85%作為閾值, 無論純合子或者雜合子的準確性都達到了99.6%, 難以判斷的數(shù)據(jù)只是過低的測序深度(<5X)和極度接近閾值邊緣的數(shù)據(jù), 顯示了該閾值的準確性和適用性.

2.3 SNP位點等位基因比率

對19個SNP位點分型的二代測序數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，如2.2節(jié)描述, 610個(99.6%)雜合子的等位基因比率在15%～85%, 1 105個(99.6%)純合子等位基因比率在15%～85%之外, 將上述純合子和雜合子具體到每個SNP位點分析.SNP位點等位基因比率如圖5所示.

圖5 SNP位點等位基因比率Fig.5 The allelic ratio of SNP loci

由圖5(a)可知，每個SNP位點的雜合子等位基因比率分布有偏差, 19個SNP位點中有16個(84%)SNP位點的雜合子偏差集中在40%～60%, 另外3個SNP位點在20%～80%.與之相對的, 19個SNP位點中純合子無明顯偏差(見圖5(b)).不同SNP位點的雜合子等位基因比率有明顯差異, 但是每一個SNP位點內等位基因偏差較小.其中最大偏差位點為rs140489, 從27.2%至100%, 相差72.8%；相對地, 最小偏差為位點rs3739470, 從19.3%至24.8%, 相差5.5%(見表2).

表2 SNP位點等位基因比率偏差

圖5顯示每個SNP位點內雜合子偏差和純合子偏差有明顯區(qū)別, 利用該差異并結合2.2節(jié)所描述的分型閾值，可以對極度接近閾值邊緣的位點做進一步分析，以便提高SNP分型的準確性.如2.2節(jié)所述, 針對等位基因比率15%～85%的閾值, 612個雜合子有2個數(shù)據(jù)偏離. 其中一個數(shù)據(jù)為rs140489, 等位基因比率100%, 去除該數(shù)據(jù)后, 該SNP位點雜合子等位基因偏差范圍從27.2%～100%降低到27.2%～66.7%, 偏差原因是位點測序深度過低(2X), 導致等位基因測序缺失；另外一個數(shù)據(jù)為rs3739470, 該數(shù)據(jù)測序深度為47X, 等位基因偏差為14.9%, 按照15%～85%的閾值, 該位點被錯誤地判斷為純合子.通過等位基因比率結合聚類分析可以糾正疑似位點的錯誤判讀. SNP位點等位基因比率偏差如表2所示， 由表2可知, SNP位點rs3739470的純合子偏差在98.1%～100%, 雜合子偏差在14.9%～24.9%, 可以判斷14.9%的偏差仍為雜合子.同樣的, 針對1 109個純合子中偏離的4個數(shù)據(jù), 其中兩個數(shù)據(jù)測序深度為5X, 偏差原因是測序深度太低, 導致隨機測序錯誤引入引起等位基因劇烈變化.另外兩個(rs5754217和rs3093024)測序深度>40X，其雜合子偏差分別在39.5%～68.0%和33.3%～61.1%；而純合子偏差分別是83.7%～100%和84.4%～100%. 按照2.2節(jié)所述閾值, 偏差83.7%和84.4%的位點為雜合子, 但結合表2中雜合子和純合子的分布差異, 可以判斷這兩個點為純合子.因此, 當測序深度≥6X, 利用15%～85%的閾值結合聚類分析, 對二代數(shù)據(jù)進行SNP分型的準確度可以達到100%.

采用二代測序技術對SNP進行分型時, 利用15%～85%的經驗性閾值判斷SNP是準確而便捷的, 但是雜合子位點等位基因比率有時會偏離但接近閾值, 原因是由于該SNP位點周圍空間構象等問題導致引物結合偏好性不同, 或者SNP位點序列特異導致PCR擴增偏好, 從而引起等位基因偏好擴增[7, 15-16].這些SNP位點中雜合子等位基因比率會偏離閾值, 針對這些偏離但接近閾值的位點, 必須結合聚類分析才能進行準確的SNP分型.

3 結 語

本文利用三輪PCR針對91個樣本進行19個SNP位點的擴增, 將擴增產物進行二代測序檢測.測序結果顯示1 721個擴增子被成功捕獲.1 721個擴增子的基因型以LDR的基因分型結果作為標準結果, 同時利用二代測序數(shù)據(jù)計算1 721個擴增子的等位基因的比率, 兩者數(shù)據(jù)結合分析確定了二代測序數(shù)據(jù)判定SNP基因型的閾值和方案.結果顯示: 測序深度≥6X, 等位基因比率在15%～85%的為雜合子, 反之為純合子, 其準確度為99.6%.但該閾值具有一定的局限性, 當雜合子或者純合子的等位基因比率接近閾值邊緣時難以準確判定, 解決方案是針對該位點進行聚類分析從而進行清晰的SNP分型.本文成功地提出了一個準確、經驗性的針對二代測序進行SNP分型的閾值, 同時利用聚類分析方案作為SNP分型閾值的補充, 有效地提高了對易出錯位點判讀的準確率.本文研究結果是利用二代測序技術對大規(guī)模樣本進行SNP分型應用的重要補充.

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(責任編輯: 楊 靜)

SNP Genotyping Based on Next Generation Sequencing Data

CHENKea,LIKaib,ZHOUYuxunb,XIAOJunhuab

(a. School of Environmental Science and Engineering; b. Institute of Biological Sciences and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China)

The next generation sequencing data were compared with ligase detection reaction(LDR) data to determine the empirical cut-off thresholds of next generation sequencing data for single nucleotide polymorphism (SNP) calling. The 19 loci from 91 human genomic DNA were amplified with multiplex polymerase chain reaction(multiplex PCR). Then, all the amplicons were sequenced in a single run on Ion torrent PGM platform.With LDR genotyping data, the empirical cut-off thresholds of next generation sequencing data for SNP calling were that sequencing depth was ≥6X and heterozygote ratio was fell in 15%-85%. Application of this method was able to accurately determine 99.6% of SNPs, but was failed to judge the data closed edge of the cut-off thresholds. Combining with clustering analysis could solve this problem for increasing the accuracy to 100%. The results of research provided an accurate, fast and empirical threshold for the next generation sequencing for single nucleotide polymorphism calling.

single nucleotide polymorphism(SNP); next generation sequencing; multiplex polymerase chain reaction(multiplex PCR)

1671-0444 (2017)03-0370-07

2016-05-17

國家自然科學基金面上資助項目(31371257)；上海市科委關鍵資助項目(14140900502)

陳 科(1988—)，男，河南焦作人，博士研究生，研究方向為核酸檢測新技術. E-mail： ck20dyj@163.com 肖君華(聯(lián)系人)，男，教授，E-mail：xiaojunhua@dhu.edu.cn

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