李 寧，張靜巖，任風(fēng)芝，張雪霞，劉建芬

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物藥物代謝工程技術(shù)中心，河北 石家莊 050015；2.華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050000)

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依諾肝素鈉樹脂脫色工藝研究

李 寧1，張靜巖1，任風(fēng)芝1，張雪霞1，劉建芬2*

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物藥物代謝工程技術(shù)中心，河北 石家莊 050015；2.華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050000)

采用脫色樹脂，對(duì)依諾肝素鈉進(jìn)行了脫色工藝研究，以脫色率和脫色收率為考核指標(biāo)，考察了樹脂型號(hào)、脫色液pH值、脫色液濃度、脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比、脫色液流速對(duì)脫色效果的影響。得到最優(yōu)的脫色工藝：使用DOWEX OPTIPORE SD-2樹脂，脫色液pH值為5.5，脫色液濃度為10.0%，脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比為1∶1.5，脫色液流速為2.0 BV· h-1。在此條件下，脫色率大于98.5%，脫色收率大于98.0%，脫色后依諾肝素鈉溶液顏色淺于歐洲藥典黃色6號(hào)，脫色后溶液顏色、效價(jià)均符合歐洲藥典，脫色前后依諾肝素鈉分子量無(wú)顯著變化。

依諾肝素鈉；樹脂；脫色

依諾肝素鈉系通過(guò)對(duì)豬腸粘膜來(lái)源的肝素芐酯衍生物解聚而獲得，由一系列未被完全定性的復(fù)雜寡糖組成。其制備過(guò)程主要包括成鹽、酯化、解聚[1]，解聚是在堿性加熱條件下進(jìn)行的，肝素芐酯發(fā)生水解反應(yīng)和β-消除反應(yīng)致肝素糖鏈斷裂，在還原端會(huì)發(fā)生葡萄糖胺與甘露糖胺的差向異構(gòu)化，末端葡萄糖胺有6-O-硫酸基化取代的會(huì)脫硫酸基，形成1,6-脫水結(jié)構(gòu)[2]。在解聚過(guò)程中疑似發(fā)生了美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致有色物質(zhì)產(chǎn)生。由于有色物質(zhì)帶有多糖的母核，與依諾肝素鈉性質(zhì)相似，溶于水，并可以與依諾肝素鈉一同醇沉，給脫色處理帶來(lái)一定困難[3]。作者通過(guò)篩選脫色樹脂型號(hào)及脫色條件，確定了最優(yōu)的依諾肝素鈉樹脂脫色工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

肝素鈉，自制；DOWEX OPTIPORE SD-2樹脂，陶氏化學(xué)；D-293樹脂，上海華震科技有限公司；LSA-700B樹脂，西安藍(lán)曉科技公司。

芐索氯銨，江蘇和創(chuàng)化學(xué)有限公司；二氯甲烷、氯化芐、甲醇、無(wú)水乙酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸，均為分析純，市售；純化水，自制。

TU-1900型紫外可見分光光度計(jì)，普析通用公司；S25-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司。

1.2 脫色前依諾肝素鈉的制備

取100 g肝素鈉用1 000 mL水溶解，再取250 g芐索氯銨用1 250 mL水溶解；將芐索氯銨溶液緩慢加至肝素鈉溶液中，離心，水洗，真空干燥，得到肝素季銨鹽；用肝素季銨鹽質(zhì)量5倍體積(體積/質(zhì)量，mL∶g，下同)的二氯甲烷溶解，再加入肝素季銨鹽質(zhì)量1倍體積的氯化芐，于35 ℃下反應(yīng)25 h，加入肝素季銨鹽質(zhì)量6倍體積的10%乙酸鈉甲醇溶液，過(guò)濾，甲醇洗滌，干燥，得肝素芐酯；加入肝素芐酯質(zhì)量25倍體積的水溶解，再加入肝素芐酯質(zhì)量9%的氫氧化鈉，62 ℃下反應(yīng)1.5 h，冷卻至20 ℃左右，同時(shí)用鹽酸中和，加入水3倍體積的甲醇醇沉，過(guò)濾，干燥，得脫色前依諾肝素鈉。

1.3 樹脂脫色實(shí)驗(yàn)

脫色前依諾肝素鈉用水溶解，水溶液偏黃，用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行可見光全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在400 nm附近溶液有明顯吸收，可通過(guò)監(jiān)測(cè)溶液在400 nm下的吸光度判斷脫色效果。

準(zhǔn)確稱取脫色前依諾肝素鈉5 g，加水溶解成一定濃度，調(diào)節(jié)溶液pH值，測(cè)定400 nm下的吸光度；加入脫色樹脂，攪拌脫色一定時(shí)間，濾除樹脂；溶液中加入溶液體積1%(質(zhì)量/體積，g∶mL)的氯化鈉，再加入溶液體積4倍的甲醇醇沉，靜置；濾除上清液，干燥，得脫色后依諾肝素鈉，稱重；加水溶解至初始脫色液體積，測(cè)定400 nm下的吸光度，按下式計(jì)算脫色率和脫色收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫色樹脂型號(hào)的篩選

取9份脫色前依諾肝素鈉用水溶解成濃度約10.0%的溶液，編號(hào)1#～9#，其中1#、2#、3#溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0，4#、5#、6#溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，7#、8#、9#溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，然后在1#、4#、7#溶液中加入SD-2樹脂，2#、5#、8#溶液中加入D-293樹脂，3#、6#、9#溶液中加入LSA-700B樹脂，樹脂均與脫色前依諾肝素鈉等重，緩慢攪拌5 h，按1.3方法進(jìn)行后續(xù)處理，結(jié)果見表1。

表1 不同型號(hào)樹脂在不同酸堿度下的脫色效果/%

Tab.1 The decolorization effect of different types of resin at different pH values/%

從表1可以看出，3種脫色樹脂脫色收率均大于96%，說(shuō)明3種脫色樹脂對(duì)依諾肝素鈉的吸附作用很??；在溶液偏酸性條件下樹脂對(duì)依諾肝素鈉的脫色效果最好，其中SD-2樹脂脫色效果最好。因此，選擇SD-2樹脂在偏酸性條件下對(duì)依諾肝素鈉進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)。

2.2 脫色液pH值的選擇

取5份脫色前依諾肝素鈉用水溶解成濃度約10.0%的溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，加入與脫色前依諾肝素鈉等重SD-2樹脂，緩慢攪拌5 h，按1.3方法進(jìn)行后續(xù)處理，結(jié)果見表2。

表2 不同pH值下的脫色效果

Tab.2 The decolorization effect at different pH values

從表2可以看出，依諾肝素鈉在pH值5.5時(shí)的脫色效果最佳。

2.3 脫色液濃度的選擇

取5份脫色前依諾肝素鈉分別用水溶解成濃度約6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5，加入與脫色前依諾肝素鈉等重SD-2樹脂，緩慢攪拌5 h，按1.3方法進(jìn)行后續(xù)處理，結(jié)果見表3。

表3 不同脫色液濃度下的脫色效果/%

Tab.3 The decolorization effect at different concentrations of decolorization solution/%

從表3可以看出，溶液濃度為8.0%～10.0%時(shí)，脫色率較高。為了降低醇沉溶劑用量，選擇較高脫色液濃度，即選擇脫色液濃度為10.0%。

2.4 脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比的選擇

取5份脫色前依諾肝素鈉用水溶解成濃度約10.0%的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5，分別按照脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比(g∶g)為1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0加入SD-2樹脂，緩慢攪拌5 h，按1.3方法進(jìn)行后續(xù)處理，結(jié)果見表4。

表4 不同脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比下的脫色效果

Tab.4 The decolorization effect at different mass ratios of enoxaparin sodium before decolorization and resin

從表4可以看出，脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比為1∶(1.0～2.0)時(shí)，脫色率較高。為了確保脫色效果，選擇使用略過(guò)量的脫色樹脂，故選擇脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比為1∶1.5。

2.5 脫色液流速的選擇

取5份脫色前依諾肝素鈉用水溶解成濃度約10.0%的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5,分別注入裝有SD-2樹脂的樹脂柱，脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比為1∶1.5，分別控制流速 (BV·h-1，樹脂床體積·h-1)為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0,按1.3方法進(jìn)行后續(xù)處理，結(jié)果見表5。

表5 不同脫色液流速下的脫色效果

Tab.5 The decolorization effect at different flow rates of decolorization solution

從表5可以看出，流速為1.0～2.0 BV·h-1時(shí)脫色率較高。為了節(jié)省脫色時(shí)間，選擇脫色液流速為2.0 BV·h-1。

2.6 動(dòng)態(tài)脫色驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取3份脫色前依諾肝素鈉測(cè)定分子量后用水溶解成濃度約10.0%的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5，分別注入裝有SD-2樹脂的樹脂柱，脫色前依諾肝素鈉與樹脂的質(zhì)量比為1∶1.5，脫色液流速為2.0 BV·h-1，脫色液用甲醇醇沉，靜置；濾除上清液，干燥，稱重，用水溶解至初始脫色液體積，測(cè)定溶液在400 nm下的吸光度，計(jì)算脫色率、脫色收率，并測(cè)定脫色后依諾肝素鈉的分子量、溶液顏色及效價(jià)，結(jié)果見表6。

表6 樹脂脫色驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.6 The verification results of decolorization with resin

編號(hào)123脫色率/%98.6198.5998.66脫色收率/%98.1398.0998.15Mw/Da 脫色前脫色后448044914452446544754482溶液顏色淺于黃色6號(hào)淺于黃色6號(hào)淺于黃色6號(hào)AXaIU/(IU·mg-1)105104103AⅡaIU/(IU·mg-1)28.027.927.5

從表6可以看出，按照選定的脫色條件進(jìn)行脫色，脫色率大于98.5%，脫色收率大于98.0%，脫色后依諾肝素鈉溶液顏色、效價(jià)均符合歐洲藥典規(guī)定[4]，脫色前后分子量無(wú)顯著變化。

3 結(jié)論

采用DOWEX OPTIPORE SD-2樹脂對(duì)依諾肝素鈉進(jìn)行脫色，確定最優(yōu)的脫色條件為：脫色前依諾肝素鈉與樹脂質(zhì)量比1∶1.5，脫色液濃度10.0%、脫色液pH值5.5，脫色液流速2.0 BV·h-1。在此條件下，脫色率大于98.5%，脫色收率大于98.0%，脫色后依諾肝素鈉溶液顏色淺于歐洲藥典黃色6號(hào)，脫色后溶液顏色、效價(jià)均符合歐洲藥典規(guī)定，脫色前后依諾肝素鈉分子量無(wú)顯著變化。

[1] DEBRIE R.Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events:US 5389618[P].1995-02-14.

[2] 張利赟.兩種低分子肝素(LWMH)生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2010.

[3] 金飛，徐飛虎，王彥廣.依諾肝素鈉的制備與純化[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39(1)：15-17.

[4] 歐洲藥典委員會(huì).歐洲藥典[S].9.0版.歐洲藥品質(zhì)理管理局，2017：2352-2354.

Decolorization Process of Enoxaparin Sodium with Resin

LI Ning1,ZHANG Jing-yan1,REN Feng-zhi1,ZHANG Xue-xia1,LIU Jian-fen2*

(1.NewDrugR&DCo.,Ltd.ofNCPC,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,Shijiazhuang050015,China; 2.HuaKunHebeiBiologicalTechnologyCo.,Ltd.ofNCPC,Shijiazhuang050000,China)

We studied the decolorization process of enoxaparin sodium with decolorizing resin.Using decolorization rate and yield of enoxaparin sodium as indexes,we investigated the effects of resin type,pH value and concentration of decolorization solution,the mass ratio of enoxaparin sodium before decolorization and resin,and the flow rate of decolorization solution on decolorization effect.The optimal decolorization conditions were as follows:DOWEX OPTIPORE SD-2 as decoloring resin,pH value of decolorization solution was 5.5,concentration of decolorization solution was 10.0%,the mass ratio of enoxaparin sodium before decolorization and resin was 1∶1.5,and flow rate was 2.0 BV·h-1.Under above conditions,decolorization rate was more than 98.5%,decolorization yield was more than 98.0%, enoxaparin sodium solution after decolorization had lighter color than yellow 6#of European Pharmacopeia (EP),the titers accorded with EP standard,and the molecular weight of enoxaparin sodium did not obviously change before and after decolorization.

enoxaparin sodium；resin；decolorization

2017-03-28

李寧(1979-)，男，河北石家莊人，高級(jí)工程師，主要從事藥物分離純化及質(zhì)量研究，E-mail：aln365@163.com；通訊作者：劉建芬，執(zhí)業(yè)藥師，E-mail：119797212@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.010

R973.2

A

1672-5425(2017)07-0047-03

李寧，張靜巖，任風(fēng)芝，等.依諾肝素鈉樹脂脫色工藝研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(7)：47-49.