申麗君，段冉冉，張志強(qiáng)，許倩倩，呂 樂(lè)，劉曉璐，尹春華，張海洋，閆 海*

(1.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100083；2.北京綠色空間生物科技股份有限公司，北京 100097)

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利用餐廚垃圾滲濾液培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌

申麗君1，段冉冉1，張志強(qiáng)2，許倩倩1，呂 樂(lè)1，劉曉璐1，尹春華1，張海洋1，閆 海1*

(1.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100083；2.北京綠色空間生物科技股份有限公司，北京 100097)

以餐廚垃圾滲濾液為培養(yǎng)基，研究了蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)的培養(yǎng)條件及其去除餐廚垃圾滲濾液中主要營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化控制條件。結(jié)果表明，當(dāng)餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)在25%～100%范圍內(nèi)時(shí)，隨餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)的增大，Bt生物量增大，Bt菌落形成單位升高，72 h達(dá)到4.5×107CFU·mL-1，對(duì)餐廚垃圾滲濾液中總有機(jī)碳(TOC)和總氮(TN)的去除率分別達(dá)到48.8%和52.4%。在餐廚垃圾滲濾液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4分別作為磷源和硫源，可以促進(jìn)Bt的生長(zhǎng)，72 h菌落形成單位達(dá)到1.4×108CFU·mL-1。表明利用餐廚垃圾滲濾液可以高效培養(yǎng)生物農(nóng)藥Bt，是廢棄物高效資源化利用的有效途徑，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

蘇云金芽孢桿菌；餐廚垃圾滲濾液；培養(yǎng)；處理

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，餐廚垃圾不斷增加。餐廚垃圾中含有75%～ 90%的水分，成分復(fù)雜，易腐敗并滋生細(xì)菌，如不進(jìn)行處理，不僅污染環(huán)境，還嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，導(dǎo)致大量生物質(zhì)能的浪費(fèi)[1-3]。餐廚垃圾滲濾液是指餐廚垃圾在壓實(shí)、發(fā)酵等生物化學(xué)降解以及降水、地下水的滲流作用下產(chǎn)生的一種高濃度有機(jī)廢水[4-5]。餐廚垃圾滲濾液的高效資源化利用是一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。目前，餐廚垃圾的主要處理方法包括物理化學(xué)法、填埋法和生物法等[6]，其中生物法主要包括堆肥制腐殖酸、發(fā)酵制氫、產(chǎn)甲烷、生產(chǎn)燃料乙醇及降解性塑料等[1]。

生物農(nóng)藥蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)對(duì)鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和雙翅目等32個(gè)科50多種昆蟲(chóng)害蟲(chóng)有不同程度的致病和毒殺作用[7]，且專(zhuān)一性高、對(duì)人畜無(wú)害、防治效果好，占微生物殺蟲(chóng)劑生產(chǎn)與銷(xiāo)售總量的95%以上[8-10]，在農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害防治中發(fā)揮著重要作用。目前，沼渣、昆蟲(chóng)尸體、酒糟酒曲、紅三葉鮮青草預(yù)加工廢水和餐廚垃圾[11-14]等有機(jī)廢棄物均可作為培養(yǎng)基原料培養(yǎng)Bt，但利用餐廚垃圾滲濾液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)Bt的研究還未見(jiàn)報(bào)道。 作者以餐廚垃圾滲濾液為培養(yǎng)基，研究了Bt培養(yǎng)條件和去除餐廚垃圾滲濾液中主要營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化控制條件，以期為高效資源化利用餐廚垃圾滲濾液提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與菌種

餐廚垃圾滲濾液，北京綠色空間生物科技股份有限公司；蘇云金芽孢桿菌NBIV-330，湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)[15]配制，餐廚垃圾滲濾液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，用Na2CO3調(diào)節(jié)pH值為6.6～6.8。

含不同體積分?jǐn)?shù)餐廚垃圾滲濾液的液體培養(yǎng)基，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 餐廚垃圾滲濾液的預(yù)處理

因餐廚垃圾滲濾液原液中不溶物較多，因此需對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理：將餐廚垃圾滲濾液在10 000 r·min-1下離心5 min，取上清液過(guò)15～20 μm中速濾膜，即得澄清餐廚垃圾滲濾液。

1.3.2 Bt培養(yǎng)條件

100 mL三角瓶，裝液量20 mL，接種量1%(體積分?jǐn)?shù)),設(shè)置3個(gè)平行樣。培養(yǎng)溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每天取樣在722S型分光光度計(jì)上測(cè)定光密度(OD680)。采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，涂布平板法測(cè)定Bt菌落形成單位(CFU)。

1.3.3 分析檢測(cè)

取Bt培養(yǎng)物，于5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后在TOC儀(島津公司，TOC-V CPH)上測(cè)定總有機(jī)碳(TOC)和總氮(TN)濃度，采用電導(dǎo)率儀(EUTECH公司，CON510)測(cè)定鹽度。

2 結(jié)果與討論

2.1 餐廚垃圾滲濾液原液的理化指標(biāo)

餐廚垃圾滲濾液原液中TOC和TN分別高達(dá)20.1 g·L-1和0.9 g·L-1，碳氮比為22.3，比較符合微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)元素要求。由于餐廚垃圾滲濾液來(lái)源于食物廢棄物，所以微生物可利用的淀粉和蛋白等含量豐富[14]，為Bt的生長(zhǎng)提供了必要且豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。餐廚垃圾滲濾液原液鹽度高達(dá)61‰，高鹽度培養(yǎng)基不利于氧的傳遞，對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用[16]。餐廚垃圾滲濾液原液pH值為3.4，由于Bt最適生長(zhǎng)pH值為中性或偏堿性，因此需調(diào)節(jié)pH值接近中性。

2.2 溫度對(duì)Bt生長(zhǎng)的影響(圖1)

圖1 溫度對(duì)Bt生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of temperature on the growth of Bt

從圖1a可知，Bt在35～41 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，但溫度越低，Bt的生長(zhǎng)速度越快、生物量越大，35 ℃時(shí)OD680最高達(dá)到9.1，與楊航聰?shù)萚15]對(duì)蘇云金芽孢桿菌MS7的研究結(jié)果一致。孫翠霞等[17]指出Bt的最適生長(zhǎng)溫度為(30±1) ℃。每種微生物都有最適生長(zhǎng)溫度，同種微生物在不同的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最適溫度也有差別。可能是因?yàn)闇囟戎苯佑绊懠?xì)菌的酶反應(yīng)體系，從而影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用，是影響B(tài)t生長(zhǎng)的重要因素。溫度過(guò)高導(dǎo)致Bt毒力效價(jià)降低，溫度過(guò)低則導(dǎo)致酶活性降低，代謝減緩，生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，產(chǎn)量降低[18]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用35 ℃培養(yǎng)Bt。

2.3 Bt的生長(zhǎng)和對(duì)TOC、TN的去除(圖2)

圖2 Bt的生長(zhǎng)和對(duì)TOC與TN的去除Fig.2 The growth of Bt and removal of TOC and TN

從圖2a可以看出，餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)越大，所獲得的Bt生物量越大，以100%餐廚垃圾滲濾液為培養(yǎng)基時(shí)，OD680最高達(dá)到8.8；以50%和25%餐廚垃圾滲濾液為培養(yǎng)基時(shí)，OD680最高分別為5.8和2.9。說(shuō)明餐廚垃圾滲濾液所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于Bt的快速生長(zhǎng)。

從圖2b可以看出，培養(yǎng)72 h，Bt的菌落形成單位隨餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，最高可達(dá)4.5×107CFU·mL-1。用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明：不同體積分?jǐn)?shù)餐廚垃圾滲濾液的P<0.01，說(shuō)明餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)對(duì)Bt的菌落形成單位有極顯著影響。

從圖2c、d可以看出，隨著B(niǎo)t的生長(zhǎng)，餐廚垃圾滲濾液中的TOC、TN去除效果明顯。當(dāng)采用100%餐廚垃圾滲濾液為培養(yǎng)基時(shí)，TOC去除率最高達(dá)48.8%，TN去除率最高達(dá)52.4%；當(dāng)餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，TOC和TN去除率有所降低，當(dāng)餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)降至25%時(shí)，TOC和TN去除率進(jìn)一步下降。表明，餐廚垃圾滲濾液的體積分?jǐn)?shù)越高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越豐富，不僅Bt的生物量越大，而且對(duì)TOC與TN的去除率也越高。從圖2c還可以看出，培養(yǎng)60 h后Bt進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期，形成芽孢且芽孢囊脫落，菌體內(nèi)容物釋放，導(dǎo)致TOC有所上升。

2.4 外加磷源和硫源對(duì)Bt生長(zhǎng)的影響(圖3)

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中額外添加1 g·L-1KH2PO4作為磷源和1 g·L-1MgSO4作為硫源后，Bt的生長(zhǎng)量明顯升高，培養(yǎng)48 hOD680達(dá)到最高，為11.5(圖3a);72 h時(shí)的菌落形成單位為1.4×108CFU·mL-1，比空白對(duì)照組的Bt菌落形成單位4.8×107CFU·mL-1提高了約3倍(圖3b)。表明，在餐廚垃圾滲濾液中補(bǔ)充磷源和硫源對(duì)Bt的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。另外，經(jīng)SPSS軟件對(duì)兩組的顯著性差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終得到P<0.01，說(shuō)明在餐廚垃圾滲濾液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4可以極明顯促進(jìn)Bt的生長(zhǎng)，與黃勤清等[19]發(fā)現(xiàn)的添加KH2PO4和MgSO4可增加Bt的菌落數(shù)以及Ozkan等[20]報(bào)道的較高濃度的無(wú)機(jī)磷可以提高Bt的殺蟲(chóng)毒性相符。

圖3 外加磷源和硫源對(duì)Bt生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of additional phosphorus source and additional sulfur source on the growth of Bt

3 結(jié)論

以餐廚垃圾滲濾液為培養(yǎng)基，研究了蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)培養(yǎng)條件和去除餐廚垃圾滲濾液中主要營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化控制條件。結(jié)果表明，當(dāng)餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)在25%～100%范圍內(nèi)時(shí)，隨餐廚垃圾滲濾液體積分?jǐn)?shù)的增大，Bt生物量增大，Bt菌落形成單位升高，72 h達(dá)到4.5×107CFU·mL-1，對(duì)餐廚垃圾滲濾液中TOC和TN的去除效果也升高，去除率分別達(dá)到48.8%和52.4%。在餐廚垃圾滲濾液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4分別作為磷源和硫源，可以促進(jìn)Bt的生長(zhǎng)，72 h菌落形成單位達(dá)到1.4×108CFU·mL-1。

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Cultivation ofBacillusthuringiensiswith Food Waste Leachate

SHEN Li-jun1,DUAN Ran-ran1,ZHANG Zhi-qiang2,XU Qian-qian1,LV Le1,LIU Xiao-lu1,YIN Chun-hua1,ZHANG Hai-yang1,YAN Hai

(1.SchoolofChemistryandBiologicalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China;2.BeijingGreenSpaceBiotechnologyCo.，Ltd.,Beijing100097,China)

In this paper,food waste leachate was successfully used to cultureBacillusthuringiensis(Bt) and the optimum conditions for the removal of the main nutrients in the leachate were also investigated.Results showed that,with the increasing of volume fraction of food waste leachate from 25% to 100%,the growth of Bt increased,the colony forming unit of Bt reached 4.5×107CFU·mL-1after 72 h,and the removal rates of total organic carbon(TOC) and total nitrogen(TN) increased to 48.8% and 52.4%,respectively.The colony forming unit of Bt reached 1.4×108CFU·mL-1after 72 h by adding 1 g·L-1KH2PO4as a phosphorus source and 1 g·L-1MgSO4as a sulfur source in leachate.It is demonstrated that food waste leachate can be efficiently used to culture biopesticide Bt,which is an efficient way to use waste as resource with great value of application.

Bacillusthuringiensis;food waste leachate;cultivation;treatment

2017-02-22

申麗君(1992-)，女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：m18811391351@163.com；通訊作者：閆海，教授，E-mail：haiyan@ustb.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.013

X172

A

1672-5425(2017)07-0061-04

申麗君，段冉冉，張志強(qiáng)，等.利用餐廚垃圾滲濾液培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(7)：61-64.