文/周慶民 徐 馨＊ 馮萬宇 張 艷 寧秀云

奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)的制定

文/周慶民1徐 馨1＊馮萬宇1張 艷1寧秀云2

（1黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所；2 訥河市動(dòng)物防疫站）

為了建立奶牛乳房炎早期診斷試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)，以目前檢測(cè)奶牛是否患有乳房炎最為準(zhǔn)確的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，以染色深淺與體細(xì)胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少與體細(xì)胞數(shù)量成正比的數(shù)量關(guān)系做對(duì)比，制定奶牛乳房炎早期診斷試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，該試劑盒判定結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映體細(xì)胞數(shù)量變化區(qū)間，準(zhǔn)確判別奶牛乳房炎發(fā)生的程度。該試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確、劃分區(qū)間細(xì)致，能夠以明確的顏色變化準(zhǔn)確快速判別奶牛乳房的狀況。

奶牛乳房炎；診斷試劑盒；DNA裂解；顯微鏡計(jì)數(shù)；判定標(biāo)準(zhǔn)

奶牛乳房炎是奶牛生產(chǎn)中發(fā)病率高、發(fā)生廣泛、危害最嚴(yán)重、造成損失最大的疾病之一，危及人類食品安全，嚴(yán)重阻礙奶牛業(yè)的健康發(fā)展。針對(duì)奶牛乳房炎早期臨床癥狀不明顯，呈隱性發(fā)生，不易判斷，研制出了奶牛乳房炎早期診斷試劑盒，其具有反應(yīng)快速、檢測(cè)便捷的特點(diǎn)。本試驗(yàn)以目前檢測(cè)奶牛是否患乳房炎最為準(zhǔn)確的直接顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)法為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，以染色顏色深淺與體細(xì)胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少與體細(xì)胞數(shù)量成正比的數(shù)量關(guān)系做對(duì)比，檢驗(yàn)本試劑盒的判定準(zhǔn)確性，同時(shí)制訂其判定標(biāo)準(zhǔn)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

乳汁：采自齊梅生物科技股份有限公司良種乳牛繁育基地。

試劑：甲基綠（廣州威佳科技有限公司）、碘化鉀（濟(jì)南嘉?；び邢薰荆?、冰醋酸（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）、醋酸鈉（南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采集乳樣

隨機(jī)在齊梅生物科技股份有限公司良種乳牛繁育基地選取奶牛50 頭，選用專用的奶牛乳頭藥浴液，對(duì)乳頭進(jìn)行藥浴，藥液作用時(shí)間保持在20～30 s。藥浴后用一次性紙巾擦干乳頭和基部，擠奶時(shí)丟棄前兩把奶，然后從第三把奶中收集50 mL接入滅菌管中。

1.2.2 顯微鏡計(jì)數(shù)

（1）涂布

充分搖勻新鮮采集的乳樣，用微量加樣器吸取滅菌管中部乳汁10 μL，將乳樣滴于玻片一端中部，仔細(xì)涂布成約1 cm2面積的乳膜。

（2）干燥、脫脂、固定

涂好乳膜的玻片于37 ℃溫箱中干燥后，用二甲苯脫脂5 min，再置于95%乙醇中固定5～10 min。

（3）染色

玻片干燥后，用美藍(lán)染色液染

色5 min。水洗，再用95%乙醇脫色數(shù)分鐘，水洗干燥后鏡檢。

（4）鏡檢及計(jì)數(shù)

在生物顯微鏡10 倍目鏡油鏡下觀察，計(jì)數(shù)視野內(nèi)100 個(gè)1 cm2面積的體細(xì)胞數(shù)，然后用下式計(jì)算：SCC=系數(shù)×每個(gè)視野的細(xì)胞平均數(shù)（細(xì)胞總數(shù)÷100），即為每毫升乳樣中的體細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 奶牛乳房炎早期診斷試劑盒檢測(cè)乳樣顏色變化

以移液槍吸取待檢奶牛乳汁樣品50 μL，加入100 μL KI裂解液，靜置2 min后加入甲基綠染色液，3 min后記錄顏色變化。

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)的制定

將顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果與奶牛乳房炎早期診斷試劑盒顏色變化結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。將同一乳樣的體細(xì)胞數(shù)顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果記入表1，另將應(yīng)用奶牛乳房炎早期診斷試劑盒檢測(cè)的乳樣顏色變化結(jié)果也填入表1，摸索體細(xì)胞數(shù)量變化與顏色變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而制定判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微鏡計(jì)數(shù)與奶牛乳房炎早期診斷試劑盒顏色變化比對(duì)結(jié)果

顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果與奶牛乳房炎早期診斷試劑盒顏色變化比對(duì)結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，體細(xì)胞數(shù)量變化區(qū)間對(duì)應(yīng)著DNA染色的顏色變化梯度，體細(xì)胞數(shù)越多，綠色越深。由表1可知，乳樣中體細(xì)胞數(shù)低于2.9×105個(gè)/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)顯色顏色為淺藍(lán)綠色；體細(xì)胞數(shù)在3.0×105～4.9×105個(gè)/mL范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)應(yīng)顯色顏色為淺綠色；體細(xì)胞數(shù)在5.0×105～7.9×105個(gè)/mL范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)應(yīng)顯色顏色為淡綠色；體細(xì)胞數(shù)在8.0×105～14.9×105個(gè)/mL范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)應(yīng)顯色顏色為綠色；體細(xì)胞數(shù)在15.0×105～49.9×105個(gè)/mL范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)顯色顏色為深綠色；體細(xì)胞數(shù)多于50.0×105個(gè)/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)顯色顏色為墨綠色。

2.2 判定標(biāo)準(zhǔn)的制定

“-”，為陰性，淺藍(lán)綠色（體細(xì)胞數(shù)為0～2.9×105個(gè)/ mL）；“±”，為疑似，淺綠色（體細(xì)胞數(shù)為3.0×105～4.9×105個(gè)/mL）；“+”，為弱陽性，淡綠色（體細(xì)胞數(shù)為5.0×105～7.9×105個(gè)/mL）；“++”，為陽性，綠色（體細(xì)胞數(shù)為8.0×105～14.9×105個(gè)/mL）；“+++”，為強(qiáng)陽性，深綠色（體細(xì)胞數(shù)為15.0×105～49.9×105個(gè)/mL）；“++++”，為極強(qiáng)陽性，墨綠色（體細(xì)胞數(shù)多于50×105個(gè)/mL）。

表1 顯微鏡計(jì)數(shù)與試劑盒染色結(jié)果表

表2 判定標(biāo)準(zhǔn)

3 討論

3.1奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判斷標(biāo)準(zhǔn)，是以目前檢測(cè)奶牛是否患有乳房炎最為準(zhǔn)確的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，對(duì)同一樣品同時(shí)用顯微鏡計(jì)數(shù)法和早期診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，比較體細(xì)胞數(shù)目多少和試劑盒染色深淺變化關(guān)系，確定早期診斷試劑盒的反應(yīng)范圍，從而制定出早期診斷試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)。

3.2本試驗(yàn)中，診斷試劑盒的顏色變化隨著體細(xì)胞數(shù)量的變化而變化，而且呈正相關(guān)，隨著乳汁中體細(xì)胞數(shù)量的增多，診斷試劑盒的顏色越變?cè)缴睿弦?guī)律性變化。

3.3本試驗(yàn)制定的奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判斷標(biāo)準(zhǔn)是按照國(guó)際上通用的乳汁中體細(xì)胞數(shù)變化范圍對(duì)應(yīng)試劑盒的顏色變化程度而確定，其判斷標(biāo)準(zhǔn)符合奶牛乳房炎的發(fā)生程度，與我國(guó)及國(guó)際對(duì)奶牛乳房炎的判斷一致，符合奶牛乳房炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本文制訂的快速診斷試劑盒診斷標(biāo)準(zhǔn)，是以目前檢測(cè)奶牛是否患有乳房炎最為準(zhǔn)確的顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)法為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，以染色顏色深淺與體細(xì)胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少與體細(xì)胞數(shù)量成正比的數(shù)量關(guān)系做對(duì)比，制定的奶牛乳房炎早期診斷試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)。判定標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確、劃分區(qū)間細(xì)致，能夠以明確的顏色變化準(zhǔn)確快速判別奶牛乳房炎發(fā)生的程度。

該試劑盒判定結(jié)果準(zhǔn)確反映體細(xì)胞數(shù)量變化區(qū)間，能夠快速判定出奶牛乳房炎發(fā)生的程度。其標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范、操作簡(jiǎn)便，判定迅速準(zhǔn)確，便于攜帶和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，為判定乳汁中體細(xì)胞數(shù)目、DNA數(shù)量及食品安全行業(yè)提供了一種經(jīng)濟(jì)、便捷、有效、現(xiàn)場(chǎng)、適時(shí)、及時(shí)的檢測(cè)手段。適用于養(yǎng)殖場(chǎng)自主大規(guī)模批量檢測(cè)篩查，也適用于平時(shí)對(duì)疑似隱性乳房炎奶牛隨時(shí)判定。比對(duì)目前判斷奶牛乳房炎結(jié)果最為準(zhǔn)確的體細(xì)胞計(jì)數(shù)法，該試劑盒顯色正確指示了體細(xì)胞數(shù)量變化關(guān)系，進(jìn)而對(duì)應(yīng)判斷出奶牛的健康情況。同時(shí)它還規(guī)避了體細(xì)胞計(jì)數(shù)法（SCC）、PCR檢測(cè)法和乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)法需要在實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)的局限性，也規(guī)避了乳汁pH值檢測(cè)法和乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)法的不準(zhǔn)確性。C

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黑龍江省省屬科研院所專項(xiàng)資金項(xiàng)目“奶牛乳房炎早期診斷盒及無抗治療劑的研究”]

周慶民（1964-），男，本科，研究員，研究方向?yàn)榕R床診療與新獸藥開發(fā)。

2017-05-20）

?通信作者：徐馨（1983-），女，漢，碩士，助理研究員，主要從事新藥開發(fā)與疾病診療。