崔小榮，李曉玲，于光輝，魏成曉，趙玲玲，鞏建飛，張廷榮，孫金海

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

轉(zhuǎn) pGH基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞系的建立及鑒定

崔小榮，李曉玲，于光輝，魏成曉，趙玲玲，鞏建飛，張廷榮，孫金海

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

本試驗(yàn)采用組織塊貼壁法對(duì)初生仔豬的耳組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，成功分離出轉(zhuǎn)pGH基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，凍存前和復(fù)蘇后細(xì)胞活力檢測(cè)，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析，波形蛋白免疫組化，染色體計(jì)數(shù)以及微生物污染檢測(cè)等生物學(xué)特性分析。結(jié)果表明，原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化和差速離心分離培養(yǎng)出成纖維細(xì)胞，7組細(xì)胞凍存前細(xì)胞活力均在為92%以上，凍存3個(gè)月后細(xì)胞復(fù)蘇活力仍在89%以上;細(xì)胞生長(zhǎng)總趨勢(shì)呈“S”型，即經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期3個(gè)階段;細(xì)胞波形蛋白免疫組化在成纖維細(xì)胞中呈陽(yáng)性反應(yīng);染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明，染色體數(shù)量穩(wěn)定;成纖維細(xì)胞的細(xì)菌、真菌、病毒和支原體檢測(cè)均為陰性。本試驗(yàn)成功建立了轉(zhuǎn)pGH基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞系。

pGH基因;轉(zhuǎn)基因豬;成纖維細(xì)胞系;細(xì)胞培養(yǎng);生物學(xué)特性

豬生長(zhǎng)激素(pGH)是由豬腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的單一肽鏈蛋白質(zhì)類激素。生長(zhǎng)激素生理作用廣泛，能夠影響幾乎所有的組織類型和細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂，可顯著影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。pGH通過(guò)IGF－I的介導(dǎo)發(fā)揮作用，是調(diào)節(jié)肌肉形成的主要內(nèi)分泌因子之一。因?yàn)樯L(zhǎng)激素在動(dòng)物生長(zhǎng)軸中的重要作用，使其一直是育種研究的熱點(diǎn)之一。1985年，科學(xué)家第1次將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胴i的受精卵獲得成功，轉(zhuǎn)基因豬與同窩非轉(zhuǎn)基因豬比較，生長(zhǎng)速度和飼料利用效率顯著提高，胴體脂肪率也明顯下降［1］。國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)pGH的應(yīng)用效果進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，證實(shí)注射生長(zhǎng)激素能夠提高豬日增重、瘦肉率，降低脂肪含量。2010年，吳明明等成功構(gòu)建了pGH基因真核表達(dá)載體，通過(guò)精子介導(dǎo)納米基因載體法成功制備轉(zhuǎn)pGH基因豬［2］，陽(yáng)性率高達(dá)45．83%。蔣亞軍等對(duì)F0代轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行熒光原位雜交確定了外源pGH基因已經(jīng)整合到染色體上，并且整合位點(diǎn)具有隨機(jī)性和差異性［3］。劉劍飛等利用SYBR Green I Real-time PCR法檢測(cè)F0代轉(zhuǎn)pGH基因母豬與非轉(zhuǎn)基因公豬配種所得的7頭轉(zhuǎn)pGH基因豬與9頭非轉(zhuǎn)基因豬3月齡生長(zhǎng)激素的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，F(xiàn)1代轉(zhuǎn)基因豬生長(zhǎng)激素平均表達(dá)水平是同窩非轉(zhuǎn)基因豬的1．77倍［4］，證實(shí)了外源pGH基因在豬體內(nèi)的穩(wěn)定傳代。此外，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)F1和F3代轉(zhuǎn)pGH基因豬分別進(jìn)行生長(zhǎng)性能測(cè)定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因豬的生長(zhǎng)、發(fā)育及胴體品質(zhì)均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因豬［5－6］。姚延珠等采用相同的方法制備出轉(zhuǎn)pGH/IGF-1雙基因豬，陽(yáng)性率為30.76%［7］。范巖巖等對(duì)轉(zhuǎn)pGH/IGF-1雙基因豬、轉(zhuǎn)pGH基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)雙基因豬個(gè)體均重比轉(zhuǎn)單基因豬的高2.83%，差異顯著(P＜0．05);轉(zhuǎn)雙基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬高7．37%，差異顯著(P＜0．05)［8］。各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均表明，pGH基因?qū)ωi的生長(zhǎng)性狀具有顯著影響，轉(zhuǎn)入的pGH基因是優(yōu)良基因。為將該優(yōu)良資源從細(xì)胞水平上長(zhǎng)期保存下來(lái)，并且為后序試驗(yàn)研究提供易于保存和獲取的試驗(yàn)材料，降低飼養(yǎng)成本，本試驗(yàn)采用組織塊貼壁法培養(yǎng)轉(zhuǎn)pGH基因豬初生仔豬的耳組織，建立轉(zhuǎn)pGH基因豬成纖維細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 轉(zhuǎn)pGH基因母豬與非轉(zhuǎn)基因公豬雜交后產(chǎn)仔7頭，采集初生仔豬耳組織帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。7頭仔豬中有4頭為轉(zhuǎn)pGH基因豬，3頭為非轉(zhuǎn)基因豬。4頭轉(zhuǎn)pGH基因豬為2頭公豬和2頭母豬，3頭非轉(zhuǎn)基因豬為2頭公豬和1頭母豬。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 DMEM，購(gòu)自Hyclone公司;胰蛋白酶、L-Glutamine、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購(gòu)自Transgen Biotech北京全式金生物技術(shù)有限公司; DPBS、二甲基亞砜(DMSO)、兔抗豬免疫血清、0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液、非必需氨基酸、青鏈霉素和Giemsa，均購(gòu)自Solarbio北京索萊寶科技有限公司;免疫組化試劑盒，購(gòu)自Biotopped北京波奧拓科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) 將采集的初生仔豬耳尖組織浸入含有雙抗的PBS中立刻帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離，原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法采用馬康［9］等的方法。

1.2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇方法采用李曉玲［10］等的方法。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 觀察原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的形態(tài)，包括細(xì)胞類型、形狀、大小、核質(zhì)比例和核仁大小等。通過(guò)姬姆薩(Giemsa)染色，于顯微鏡下觀察染色后細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞凍存前和復(fù)蘇后活力檢測(cè) 在凍存前和復(fù)蘇后分別取90μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)盼藍(lán)染色液染色后，用血球計(jì)數(shù)板記染成藍(lán)色的死細(xì)胞數(shù)和未染色的活細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算活細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線繪制 取24孔培養(yǎng)板，每孔接種1．0×104個(gè)細(xì)胞。將其置于恒溫培養(yǎng)箱(37．5℃，5．0%CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)。從接種時(shí)間算起，每24 h取3孔細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，求平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)9 d，直至細(xì)胞密度降低為止。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 免疫組化鑒定 當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%左右時(shí)，采用S-P法進(jìn)行免疫組化，按照試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，DAB溶液顯色5～10 min，用蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 成纖維細(xì)胞染色體制片 選擇80%～90%匯合的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，于4℃冰箱中放置6 h，消化細(xì)胞后常規(guī)方法進(jìn)行染色體制片，具體步驟采用張德福［11］等的方法稍加改進(jìn)。Giemsa染色后在顯微鏡下觀察并拍照。隨機(jī)選取100個(gè)鋪展完好的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

1.2.8 微生物污染檢測(cè) 細(xì)菌檢測(cè):將待檢細(xì)胞在無(wú)雙抗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 d，觀察培養(yǎng)液是否變渾濁或者變黃;真菌檢測(cè):觀察培養(yǎng)液是否出現(xiàn)云霧狀，于顯微鏡觀察是否出現(xiàn)纖維狀菌絲體或密集孢子;病毒檢測(cè):于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，觀察有無(wú)蝕斑、空斑等損傷情況;支原體檢測(cè):Hoechst 33258 DNA熒光染色法染色后將玻片置于熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞的熒光分布狀態(tài)，判斷是否有支原體污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

2.1.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)觀察 圖1A顯示為培養(yǎng)48 h后細(xì)胞形態(tài)，可觀察到組織塊附近有少量梭形、不規(guī)則三棱形的成纖維細(xì)胞游離生長(zhǎng)，除此細(xì)胞外還有橢圓形或圓形的上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)，沒(méi)有組織塊的區(qū)域細(xì)胞密度極低。圖1B顯示為培養(yǎng)至第7天時(shí)細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)皿皿底長(zhǎng)滿細(xì)胞，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

圖1 原代細(xì)胞培養(yǎng) (×100)A:原代培養(yǎng)2 d后的細(xì)胞形態(tài);B:原代培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞形態(tài)

2.1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)形態(tài)觀察 當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行傳代，采用胰酶消化法和差速離心法可將成纖維細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞及其他細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)，胰酶消化后的細(xì)胞形態(tài)如圖2 A所示。經(jīng)3～4代培養(yǎng)的細(xì)胞僅剩成纖維細(xì)胞，經(jīng)傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。傳代后的細(xì)胞形態(tài)如圖 2 B所示。

圖2 傳代后成纖維細(xì)胞形態(tài)(×100)A:胰酶消化后細(xì)胞形態(tài);B:傳代后細(xì)胞形態(tài)

2.1.3 染色后細(xì)胞形態(tài)觀察 經(jīng)Giemsa染色后觀察，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、不規(guī)則三角形或扁平狀星形，核較大，卵圓形，胞質(zhì)較多，為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。染色結(jié)果如中插彩版圖3所示。

2.2 細(xì)胞凍存前與復(fù)蘇后活力檢測(cè)結(jié)果 將凍存3個(gè)月的細(xì)胞復(fù)蘇，復(fù)蘇的細(xì)胞在6 h后大量貼壁，24 h后大部分細(xì)胞都已貼壁并呈梭形生長(zhǎng)。培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，去除死細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)4～5 d細(xì)胞匯合至80%～90%，即可進(jìn)行傳代。轉(zhuǎn)pGH基因豬與同期培養(yǎng)的非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后活力較凍存前細(xì)胞活力稍有下降，轉(zhuǎn)pGH基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬凍存前細(xì)胞活力均在90%以上，復(fù)蘇后均在89%以上。凍存前和復(fù)蘇后的成纖維細(xì)胞均有較高的活力，說(shuō)明本細(xì)胞的活性較好，并且凍存方法適宜。

2.3 生長(zhǎng)曲線繪制 轉(zhuǎn)pGH基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，分為潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期3個(gè)階段。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，生長(zhǎng)曲線如圖4所示。

2.4 免疫組化鑒定結(jié)果 細(xì)胞波形蛋白在成纖維細(xì)胞中呈陽(yáng)性反應(yīng)，如圖5所示，細(xì)胞漿內(nèi)呈大量黃色顆粒狀沉淀，即可確認(rèn)為成纖維細(xì)胞。

表1 轉(zhuǎn)pGH基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

圖4 轉(zhuǎn)pGH基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.5 染色體觀察結(jié)果 公豬和母豬成纖維細(xì)胞中期分裂相染色體如圖6、圖7所示，染色體形態(tài)正常，數(shù)目為2n=38。分別對(duì)所培養(yǎng)的7組成纖維細(xì)胞所制染色體玻片計(jì)數(shù)100個(gè)4～5代細(xì)胞的染色體數(shù)目，染色體眾數(shù)2n=38的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比均在90%以上，均達(dá)到建立細(xì)胞系75%～80%的要求，所建細(xì)胞系為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系。

圖5 成纖維細(xì)胞免疫組化鑒定結(jié)果(×100)

圖6 公豬成纖維細(xì)胞中期分裂相染色體(×1 000)

圖7 母豬成纖維細(xì)胞中期分裂相染色體(×1 000)

2.6 微生物污染檢測(cè)結(jié)果

2.6.1 細(xì)菌、真菌及病毒檢測(cè)結(jié)果 顯微鏡觀察工作液培養(yǎng)的細(xì)胞，未見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁，也無(wú)絲狀物生長(zhǎng)，顯微鏡下觀察無(wú)空斑、蝕斑現(xiàn)象，表明細(xì)菌、真菌及病毒檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。

2.6.2 支原體檢測(cè)結(jié)果 Hoechst 33258熒光染料檢測(cè)，如中插彩版圖8所示細(xì)胞核呈藍(lán)色橢圓狀或圓狀，表明細(xì)胞內(nèi)無(wú)支原體存在，結(jié)果呈陰性。

3 討論

3.1 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和凍存 目前原代細(xì)胞培養(yǎng)主要有組織塊貼壁法和酶消化法2種。酶消化法是利用胰酶的消化作用使細(xì)胞從組織中游離，收集游離出的有活性的單個(gè)細(xì)胞或是細(xì)胞團(tuán)接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)［13］。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是接種后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，利于后續(xù)試驗(yàn)，但是胰酶作用時(shí)間長(zhǎng)易對(duì)細(xì)胞造成損傷，損傷后細(xì)胞不易貼壁，細(xì)胞活性下降，消化時(shí)間難把握，適用于胎兒組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊法是將所取得的動(dòng)物組織，在無(wú)菌條件下剪碎、或機(jī)械分散成適當(dāng)體積的組織塊，將組織塊接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞在組織塊周圍分裂增殖形成生長(zhǎng)暈，最終匯合鋪滿整個(gè)皿底。此方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)動(dòng)物損傷?。?1］，對(duì)組織和細(xì)胞損傷小，但組織來(lái)源的年齡大小、生理狀態(tài)對(duì)后續(xù)試驗(yàn)影響較大，老病動(dòng)物體的組織不適合細(xì)胞培養(yǎng)。本研究直接使用初生仔豬打耳號(hào)剪下的耳組織采用組織塊貼壁法進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)，試驗(yàn)成本低，而且對(duì)動(dòng)物的存活和正常生長(zhǎng)沒(méi)有任何不良影響。

3.2 成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)姬姆薩染色后呈長(zhǎng)梭形、不規(guī)則三角形或扁平狀星形，可初步判斷所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。波形蛋白是特異性存在于成纖維細(xì)胞中的中間絲纖維。純化后的細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白免疫組化試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞包漿中有大量黃色顆粒狀沉淀，可以確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。細(xì)胞的生長(zhǎng)符合細(xì)胞生長(zhǎng)的一般規(guī)律，每一代的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程有3個(gè)階段［13］，分為潛伏期(第1～2天)、指數(shù)生長(zhǎng)期(第3～6天)和平臺(tái)期(第7天開(kāi)始)3個(gè)階段。在潛伏期，由于細(xì)胞需適應(yīng)環(huán)境并恢復(fù)損傷，細(xì)胞需重新貼壁生長(zhǎng)，此階段沒(méi)有細(xì)胞增殖。潛伏期后進(jìn)入細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞大量分裂、增殖，逐漸鋪滿整個(gè)空間，隨著細(xì)胞密度的增大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，代謝物質(zhì)逐漸增多，細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，進(jìn)入停滯期。其生長(zhǎng)特點(diǎn)與太湖豬成纖維細(xì)胞［14］和巴馬香豬成纖維細(xì)胞［15］基本一致。染色體的數(shù)目、形狀、結(jié)構(gòu)為不同生物所特有，在生物的繁殖進(jìn)化以及生物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育中，保持相對(duì)的穩(wěn)定性，體外細(xì)胞培養(yǎng)，可用作細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究，以確定細(xì)胞供體的種屬、供體的性別等特征［16］。但是細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，由于細(xì)胞生活環(huán)境的變化，染色體容易發(fā)生缺失、重組或斷裂，因此染色體形態(tài)觀察和數(shù)目統(tǒng)計(jì)是確定細(xì)胞建系是否成功的關(guān)鍵［17］。正常豬的染色體數(shù)目為2n=38，本試驗(yàn)通過(guò)染色體制片后獲得分裂相良好的染色體玻片，在顯微鏡下觀察染色體的形態(tài)并對(duì)染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，染色體的數(shù)目穩(wěn)定在2n=38，染色體數(shù)目正常的比例均在90%以上，達(dá)到建立細(xì)胞系的要求。

3.3 成纖維細(xì)胞的應(yīng)用 王蓉蓉獲取北山羊肌肉組織成功建立成纖維細(xì)胞系的體外培養(yǎng)體系，北山羊?yàn)閲?guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，成纖維細(xì)胞系的成功建立使得北山羊的遺傳資源從細(xì)胞水平上長(zhǎng)期保存下來(lái)［18］。張明軍利用肝臟特異性啟動(dòng)子α1人抗胰蛋白酶啟動(dòng)子構(gòu)建肝臟特異性表達(dá)豬源Cre重組酶表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)入小型豬胚胎成纖維細(xì)胞，得到肝臟特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞，為后續(xù)構(gòu)建肝臟特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因豬研究奠定了基礎(chǔ)［19］。De Haan等對(duì)谷胱甘肽過(guò)氧化酶基因敲除的小鼠成纖維細(xì)胞系進(jìn)行建立，為進(jìn)一步研究活性氧導(dǎo)致衰老的病理生理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)［20］。Amir等建立轉(zhuǎn)hFIX基因羊成纖維細(xì)胞系，通過(guò)體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆羊，作為乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)凝血因子IX［21］。成纖維細(xì)胞已被廣泛用于生產(chǎn)體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞以及生理病理學(xué)研究。成纖維細(xì)胞系建立可以使優(yōu)良的遺傳資源從細(xì)胞水平上長(zhǎng)期保存下來(lái)，為在細(xì)胞水平上研究轉(zhuǎn)基因豬的生理機(jī)理以及構(gòu)建基因組文庫(kù)，基因遺傳多樣性研究等方面提供理想的生物學(xué)材料。

4 結(jié)論

本研究采用組織塊貼壁法，通過(guò)純化培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)觀察、免疫組化、染色體分析、微生物污染檢測(cè)等方法確定成功建立轉(zhuǎn)pGH基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞系，經(jīng)凍融試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞系能夠穩(wěn)定傳代和保存，為轉(zhuǎn)基因豬的后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。

［1］ Hammer R E，Pursel V G，Rexroad C E，et al．Production of transgenic rabbits，sheep and pigs by microinjection［J］．Nature，1985，315(10):680-683．

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The Establishment and Identification of Fibroblast Cell Lines with pGH Transgenic Pigs andnon-transgenic pigs

CUI Xiao-rong，LI Xiao-ling，YU Guang-hui，WEI Cheng-xiao，ZHAO Ling-ling，GONG Jian-fei，ZHANG Ting-rong，SUN Jin-hai
(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)

In this study，we adopted the method ofexplants cell culture for the newborn piglets’ears to the primary culture，isolated pig fibroblasts cells from pGH transgenic pigs and non-transgenic pigs．Morphological observation，determination of viability before cryopreservation and after recovery，dynamic growth analysis，vimentin immunohistochemistry，chromosome counts and microbial contamination detection were all done to study the biological characteristics of the cell lines．The results showed that the fibroblasts were cultured and isolated successfully by trypsin digestion and differential centrifugation．The viability of seven cell lines was above 92%and 89%before cryopreservation and after recovery，respectively．The growth curves were sigmoid，and experienced the incubation period，exponential growth period and platform period．The vimentin immunohistochemistry was positive．The chromosome counting showed that the number of chromosomes was stable．The microbial contamination detection was negative．The results indicate that the fibroblast cell lines of pGH transgenic pigs and non－transgenic pigs are successfully established．

pGH gene;transgenic pigs;fibroblast cell line;cell culture;biological characteristics

s:SUN Jin-hai;ZHANG Ting-rong

S828

A

0529-6005(2017)06-0003-05

2017-02-09

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2016ZX08006－003);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT－08－13)

崔小榮(1990-)，男，碩士生，主要從事分子遺傳與動(dòng)物育種研究，E-mail:18765908861@163．com

孫金海，E-mail:sunjinhai00528@sina．com;張廷榮，E-mail:zhangtr2006@126．com