高國強(qiáng)，曹 禹，吳丹丹，劉 宇，周玉龍，侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

黑龍江某豬場哺乳仔豬腹瀉病因分析

高國強(qiáng)，曹 禹，吳丹丹，劉 宇，周玉龍，侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展，豬病也愈加復(fù)雜，尤其是仔豬腹瀉已經(jīng)成為當(dāng)前影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的主要因素之一。引起仔豬腹瀉的因素比較復(fù)雜，主要分為三類，一是環(huán)境和生產(chǎn)管理因素，如衛(wèi)生條件差，環(huán)境濕度過大，溫度不穩(wěn)定，日糧配比不合理等;二是細(xì)菌性腹瀉，病原主要有大腸桿菌、沙門菌、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌等;三是病毒性腹瀉，主要有豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等;此外，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、附紅細(xì)胞體等有時(shí)也可導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀。

目前，哺乳仔豬腹瀉以豬流行性腹瀉病毒感染最為常見，一旦與其他病原混合感染，使病情更加復(fù)雜。關(guān)于豬流行性腹瀉病毒與豬偽狂犬病病毒和圓環(huán)病毒Ⅱ型混合感染的病例少見報(bào)道。2016年4月份，黑龍江某豬場哺乳仔豬暴發(fā)腹瀉，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷確診病原為豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型混合感染，現(xiàn)將該病例報(bào)道如下。

1 材料

1.1 主要試劑 TRIZol Reagent(invitrogen);Rever-Tra Ace qPCR RT Master Mix、pMD18-T載體和DNA Marker DL-2 000(TaKaRa公司);碧云天DNA提取試劑盒;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 引物 參照文獻(xiàn)和國家或者地方診斷標(biāo)準(zhǔn)合成 PEDV(NY/T 544－2015)、TGEV(NY/T 548－2015)、RV［1］、CSFV［2］、PRRSV(DB33/T 822－2011)、PRV(GBT 18641－2002)和PCV(GBT 21674－2008) PCR診斷引物，PEDV M和 ORF3基因擴(kuò)增引物［3］等。

1.3 樣本 無菌采集3日齡、10日齡和15日齡發(fā)病仔豬的內(nèi)臟器官和腸道內(nèi)容物。

2 方法

2.1 臨床診斷 通過流行病學(xué)、臨床癥狀和病理剖檢進(jìn)行初步診斷。

2.2 實(shí)驗(yàn)室診斷 根據(jù)臨床診斷結(jié)果對能夠引起哺乳仔豬腹瀉的主要病原體，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬輪狀病病毒(RV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、圓環(huán)病毒(PCV)和大腸桿菌等進(jìn)行檢測。

2.2.1 病毒檢測 應(yīng)用PCR方法對PEDV、TGEV、RV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV等病毒進(jìn)行檢測。

2.2.1.1 病毒的核酸制備 不同組織或者腸內(nèi)容物總RNA制備按照TRIZol Reagent 試劑盒說明書

2.2.1.2 cDNA合成 按照Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒操作。取8μL RNA，65℃水浴5 min，迅速放入冰盒冰浴2 min。再加入2μL 5×RT Master Mix。37℃15 min，50℃5 min，98℃5 min。

2.2.1.3 PCR 反應(yīng)體系25μL:r Taq Mix 12．5μL，去離子水 8．5μL，上、下游引物(25 pmol/μL)各1μL，cDNA 2．0μL。反應(yīng)條件:94℃10 min;94℃45 s，55℃(PEDV)/55℃(TGEV)/56℃(RV)/ 56℃(CSFV)/55℃(PRRSV)/65℃(PRV)/62℃(PCV)/56℃(PEDV ORF3)45 s，72℃90 s，35個(gè)循環(huán);72℃10 min，取反PCR產(chǎn)物15μL，在1%瓊脂糖凝膠中電泳23 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2.3 PEDV M和ORF3基因序列分析 為了探討該豬場流行的PEDV與當(dāng)前流行毒株和疫苗毒株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為PEDV的防控提供理論依據(jù)，對3頭病死豬體內(nèi)的PEDV M和ORF3基因進(jìn)行測序分析。按照常規(guī)方法，將純化后的M和ORF3 PCR產(chǎn)物分別連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中得到重組菌，提取質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定陽性的重組菌株委托北京華大基因研究中心進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast分析，然后選取典型PEDV毒株應(yīng)用DNA-Star軟件進(jìn)行同源性分析。

2.4 病原菌檢測 分別把仔豬內(nèi)臟器官和小腸內(nèi)容物接種TSA、血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、S.S.瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征，進(jìn)行革蘭染色鏡檢和純培養(yǎng)。

2.5 細(xì)菌致病性試驗(yàn) 將小腸內(nèi)分離的大腸桿菌接種到普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于空氣浴搖床中180 r/min，37℃培養(yǎng)12 h。然后腹腔接種5只小鼠體重(18～25)g，1×109CFU/只，同時(shí)設(shè)對照組5只小鼠，注射同等計(jì)量的營養(yǎng)肉湯，連續(xù)觀察1周。

3 結(jié)果

3.1 臨床診斷結(jié)果 發(fā)病豬場存欄母豬2 000頭，哺乳仔豬暴發(fā)腹瀉，發(fā)病率60%，死亡率80%。哺乳仔豬各日齡段均有腹瀉發(fā)生，多數(shù)伴有震顫、抽搐、鳴叫等神經(jīng)癥狀。產(chǎn)房的仔豬出現(xiàn)體溫升高，有的鄰窩仔豬卻無異常。尸體剖檢可見仔豬消瘦，體表有糞便附著;全身淋巴結(jié)腫大;腎臟畸形，表面有針尖狀出血點(diǎn)，腎盂內(nèi)有尿酸鹽沉積;膀胱黏膜有散在出血點(diǎn);肺臟膈葉輕微水腫;肝臟腫大、邊緣有出血點(diǎn)，腹面有針尖狀壞死灶;小腸壁變薄，內(nèi)容物稀薄，其他臟器未見異常。

3.2 病毒PCR鑒定結(jié)果 PEDV、PRV和PCV-2分別擴(kuò)增出與目的基因大小相符的特異性DNA片段，目的基因分別為774 bp、217 bp和1154 bp(見圖1、2、3)。CSFV、PRRSV、RV和 TGEV PCR結(jié)果為陰性。

圖1 PEDV基因序列RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 PRV基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 PCV基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3 PEDV病毒M基因序列分析結(jié)果 3株P(guān)EDV中國ZD毒株M基因全長均為681 bp?；贛基因的核苷酸序列分析顯示，與標(biāo)準(zhǔn)株CV777相比，M基因37位由G→C，125位由T→C，180位由G→A，198、213、222、234、258位由C→T，285、618位由T→C，348位由T→A，640位由G→T。另外，毒株China ZD－1(KX852349)的17、146位由T→C，毒株China ZD－2(KX852350)的71位由T→A，659位由A→G。毒株China ZD－3(KY010201)的6位由T→C，320、604位由A→G。所推導(dǎo)的氨基酸序列分析顯示，China ZD－1的49位由M→T，China ZD－2的24位由I→N。其他結(jié)果如圖4所示。

圖4 M基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析

3.4 M基因的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸同源性分析 3株P(guān)EDV中國ZD毒株M基因核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.3%～99.4%和97.8%。與國內(nèi)疫苗株CV777(AF353511)相比，核苷酸和氨基酸的同源性為97.7%～97.8%和97.4%。與意大利毒株Italy/178509/2014(KT027429)同源性最近為100%。與2011年1株中國毒株ZY(KF150217)相對較近為99.6%和99.1%，與泰國毒株08NP05 (FJ196176)同源性相差最大為87.1%，其他結(jié)果如圖6所示。

3.5 PEDV病毒ORF3基因序列分析結(jié)果 3株P(guān)EDV中國ZD毒株ORF3基因全長為675 bp?；贠RF3基因的核苷酸序列分析顯示，與標(biāo)準(zhǔn)株CV777相比，ORF3基因497、517位由A→G，160、235、301位由G→A，162、360、393、501位由T→C，237、243、264、274、369、439、450、489位由 C→T，238、546位由 T→G。另外，毒株 China ZD－1 (KX852337)的54位由G→A，62位由T→C，63位由C→T，毒株China ZD－2(KX852325)的32位由A→G，54位由G→A，62位由T→C，63位由C→T，毒株China ZD－3(KX852324)的152位由G→A。所推導(dǎo)的氨基酸序列分析顯示，80位由F→V，92位由L→F。其他結(jié)果如圖5所示。

3.6 ORF3基因的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸同源性分析 3株P(guān)EDV中國ZD毒株ORF3基因核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.7% ～99.9%和98.7%～99.1%。它們與2014年1株日本毒株14JM－40(KT968512)為99.4% ～99.6%和98.7% ～99.1%;與2014年1株中國毒株LNCT2(KT323980)為99.4%～99.6%和93.3%～99.1%，與國內(nèi)疫苗株 CV777(AF353511)和韓國疫苗株 DR13 (EU054930)基因和氨基酸親源性較遠(yuǎn)，基因同源性分別為96.6%～96.7%和97.6%～97.8%，氨基酸同源性分別為95．1%～95.6%和97.1%～97.6%，但是與3株毒株同源性最近的是2011年中國毒株CH/HLJHRB/2011(JQ027026)、CH/HBXX3/11 (JQ664731)和2013年美國毒株USA/Tennesse56/ 2013(KJ645654)，同源性為98.7%～99.1%。其他結(jié)果如圖7所示。

圖5 ORF3基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析

圖6 M基因氨基酸序列的遺傳進(jìn)化分析

圖7 ORF3基因氨基酸同源性的遺傳進(jìn)化分析

3.7 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 在3頭被檢測仔豬腸道內(nèi)均分離到1種革蘭陰性桿菌，在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上紫色有金屬光澤，在S.S.培養(yǎng)基上呈粉色菌落，與大腸桿菌特征相符［6］，其他內(nèi)臟器官中未分離出細(xì)菌。大腸桿菌接種小鼠以后，連續(xù)觀察7 d試驗(yàn)組與對照組小鼠均無異常反應(yīng)，說明該大腸桿菌無致病性。

4 討論

綜合臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果表明，該豬群暴發(fā)的哺乳仔豬腹瀉主要是由PEDV、PRV和PCV-2三種病毒混合感染所致。新生仔豬腹瀉目前已成為阻礙養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一，其病因復(fù)雜多樣導(dǎo)致臨床上防控該病異常困難。近幾年P(guān)EDV引起的新生仔豬腹瀉7日齡之內(nèi)死亡率較高，本次哺乳仔豬暴發(fā)腹瀉與以往不同之處表現(xiàn)為各個(gè)日齡段均有腹瀉，而且各個(gè)階段死亡率均較高，同時(shí)新生仔豬伴發(fā)神經(jīng)癥狀，這與PEDV混合感染PRV和PCV-2有直接關(guān)系。一般情況下，在新生仔豬腹瀉方面進(jìn)行病原學(xué)診斷時(shí)優(yōu)先檢測PEDV、TGEV、RV以及大腸桿菌，而本次病例警示我們，在哺乳仔豬腹瀉診斷時(shí)不要忽視PRV和PCV-2。通過最近報(bào)道來看，PEDV、PRV和PCV-2混合感染可能有增加的趨勢，這為目前的仔豬腹瀉防控提出了新的挑戰(zhàn)［4－5］。因此，PRV和PCV-2的有效防控對于降低新生仔豬腹瀉的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。

冠狀病病毒ORF5基因編碼的M蛋白是膜糖蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要的作用，同時(shí)也是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)重要的結(jié)構(gòu)蛋白。對于不同的冠狀病病毒來說，M基因的同源性是很低的，但是對于同種冠狀病病毒來說M基因確是高度保守的。而ORF3對于PEDV來說，被認(rèn)為是一個(gè)重要的毒力基因［6－8］。ORF3基因在野生型和減毒型之間的差異可以作為分子標(biāo)記，并作為研究分子流行病學(xué)的潛在工具［7］。因此，M和ORF3基因常用于分析PEDV的分子流行病學(xué)。通過對本次腹瀉仔豬體內(nèi)的PEDV M和ORF3基因序列分析結(jié)果表明，本次檢測的3份樣本的PEDV M和ORF3基因同源性99.3% ～99.4%和99.7% ～99.9%，說明本場流行的PEDV毒株為不同的毒株。該3株毒株與國內(nèi)外的毒株都存在著差異。目前沒有特效藥物用于治療PEDV，其防控主要依靠疫苗，而不同地域的PEDV毒株差異較大，可能是本豬場免疫了PEDV、TGEV和RV三聯(lián)弱毒疫苗還依然暴發(fā)仔豬腹瀉的原因，可見研制適合本地區(qū)或者豬場的特色疫苗對于防控PEDV具有重要意義。

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2016-11-17

高國強(qiáng)(1991-)，男，碩士，主要從事獸醫(yī)傳染病學(xué)的研究，E-mail:2426456777qq．com

周玉龍，E-mail:zhouyulong1980@163．com進(jìn)行，DNA制備按照碧云天DNA提取試劑盒說明書操作。