梅 晨，李淑芳，閆 旭，侯 婷，張培君，龔玉梅，王宏俊

(1．北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097;2．北京市延慶區(qū)農(nóng)業(yè)局，北京 延慶 102100)

北京油雞混合感染副雞禽桿菌和禽偏肺病毒的診治

梅 晨1，李淑芳1，閆 旭1，侯 婷2，張培君1，龔玉梅1，王宏俊1

(1．北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097;2．北京市延慶區(qū)農(nóng)業(yè)局，北京 延慶 102100)

副雞禽桿菌(Apg)為雞傳染性鼻炎的致病菌，本病的特點(diǎn)是潛伏期短，傳播迅速，短時間內(nèi)便可波及全群［1］。處于產(chǎn)蛋高峰的雞群產(chǎn)蛋大幅度降低(10%～40%)，混合感染時會導(dǎo)致病雞死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失，我國自1987年首次在北京分離到該菌后［2］陸續(xù)在不同省市分離到不同血清型的副雞禽桿菌［3－5］。禽偏肺病毒會引起一種以禽呼吸道癥狀、頭部腫脹和產(chǎn)蛋率下降為主要特征的疾病，該病毒屬于副黏病毒科、肺病毒亞科、肺病毒屬［6］，于1978年首次發(fā)現(xiàn)于南非共和國［7］，現(xiàn)已成為危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一，禽偏肺病毒對火雞的影響非常明確，但對雞的影響卻知之甚少，一般認(rèn)為可以引起雞的呼吸道感染而且是導(dǎo)致肉雞腫頭綜合征的重要誘因之一［8］。近年來由于養(yǎng)殖水平的提高及雞場保健意識的增強(qiáng)，單純的雞傳染性鼻炎在規(guī)?；u場已經(jīng)很少發(fā)病，但是如果混合感染了其他病原，導(dǎo)致抵抗力下降時，副雞禽桿菌會大量增殖，引起比較嚴(yán)重的呼吸道疾病。本實驗室于2016年3月接診了1例這兩種病原混合感染的病例，報告如下。

1 臨床癥狀

初期病雞出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀，表現(xiàn)為流鼻涕、甩鼻，隨著病情發(fā)展，病雞精神委靡，進(jìn)食量減少，呼吸啰音，面部一側(cè)或雙側(cè)腫脹，重者雙眼因腫脹而完全失明，羽毛松亂，瘦弱。產(chǎn)蛋率急劇下降達(dá)30%。

2 剖檢變化

剖檢可見單側(cè)或雙側(cè)眶下竇腫脹，內(nèi)有膿性分泌物;部分雞喉部及氣管有干酪樣滲出物;產(chǎn)蛋雞可見輸卵管萎縮，卵黃性腹膜炎。

3 實驗室診斷

3.1 細(xì)菌學(xué)分離鑒定

3.1.1 細(xì)菌分離 無菌操作采取病死雞眶下竇積液接種于TSA培養(yǎng)基，于厭氧罐中37℃培養(yǎng)16 h左右，挑取疑似副雞禽桿菌的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，連續(xù)3代以后平板上可見單一的針尖樣菌落。

3.1.2 PCR鑒定及分型 參考陳小玲［9］的方法，用1對特異性引物:F:5'-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3';R:5'-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3'，做菌種鑒定。結(jié)果顯示，可以擴(kuò)增出與預(yù)期條帶大小相同的DNA片段。初步鑒定為副雞禽桿菌(圖1)。

同時，參照Ryuichi SAKAMOTO［10］的分子分型方法，用如下分型引物進(jìn)行分型鑒定:ABCF:5'-GGCTCACAGCTTTATGCAACGAA-3';

AR:5'-CGCGGGATTGTTGATTTTGTT-3'; BR:5'-GGTGAATTTCACCACACCAC-3';

CR:5'-TAATTTTCTTATTCCCAGCATCAATACCAT-3'，結(jié)果如圖2所示，表明本次分離的副雞禽桿菌為A型。

圖1 PCR檢測結(jié)果

3.1.3 血清型鑒定 參考Page程序進(jìn)行HA和HI試驗鑒定副雞禽桿菌分離株的血清型［11］，分離株與800倍稀釋后的A型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生陽性反應(yīng)(表1)，而與B型和C型副雞禽桿菌的特異性陽性血清沒有反應(yīng)。表明該分離株屬于 A型副雞禽桿菌。

圖2 PCR檢測結(jié)果

表1 Page方法的HI分型結(jié)果

3.1.4 回歸雞試驗 取6周齡SPF雞8只，眶下竇接種細(xì)菌分離物，106CFU/mL，0．2 mL/只，并設(shè)PBS接種空白對照，觀察發(fā)病情況。接種后24 h，所有分離培養(yǎng)的細(xì)菌接種后的試驗雞均出現(xiàn)了典型的雞傳染性鼻炎癥狀，而對照雞沒有任何臨床癥狀。

3.1.5 藥敏試驗 取分離的培養(yǎng)菌按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示，分離株對頭孢氨芐、慶大霉素、頭孢哌酮、頭孢克羅高度敏感;對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、卡那霉素、頭孢拉定中度敏感;對磺胺嘧啶、土霉素、強(qiáng)力霉素、頭孢克肟不敏感(表2)。

表2 分離株藥敏試驗結(jié)果 (mm)

3.2 禽偏肺病毒核酸鑒定

3.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將氣管棉拭子浸泡于PBS中充分洗下待檢病料后按照TRIZol說明書操作進(jìn)行RNA提取，最后用5μL DEPC水溶解。反轉(zhuǎn)錄按照M-MLV Reverse Transcriptase說明書進(jìn)行，具體反應(yīng)體系如下:RNA 5μL，隨機(jī)引物1μL，5× M-MLV RT Buffer 4μL，核糖核酸酶抑制因子1μL， M-ML反轉(zhuǎn)錄酶1μL，dNTP(2．5 mmol/L)8μL?；靹蚝蟀匆韵鲁绦蜻M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄:42℃ 50 min，70℃15 min，反應(yīng)結(jié)束后，立即置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2 PCR檢測 根據(jù)GenBank發(fā)表的禽偏肺病毒的Matrix(M)基因(登錄號為KF364615．2)的保守序列設(shè)計引物:上游引物5'-GAT GAC TAC AGC AAA CTA GAG-3';下游引物5'-CTT CAG GAC ATA TCT CGT AC-3'。預(yù)計擴(kuò)增片段大小為468bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系為20μL:cDNA 2μL，2×PCR Buffer 10μL，上、下游引物各1μL，以ddH2O加足體系。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 45 s，51℃ 45 s，72℃ 45 s，進(jìn)行30個循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 uL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果能成功擴(kuò)增出目的條帶(圖3)。

圖3 PCR檢測結(jié)果

3.2.3 DNA序列分析 按照膠回收試劑盒說明書回收目的片段，在參照pGEM－T載體試劑盒說明書構(gòu)建克隆載體。經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性克隆子后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。使用DNAStar軟件將測序結(jié)果與GenBank中登錄的M基因進(jìn)行序列比對分析(圖4)，結(jié)果顯示與 C亞型(登錄號為 FJ195332．1—FJ19534．1，F(xiàn)J5344．1，F(xiàn)J195345．1)核苷酸序列同源性極高，為96%～99%，同時也表明同一亞型不同毒株的這段基因相對比較保守，由以上結(jié)果確定病料中含有C型禽偏肺病毒。

圖4 序列比對結(jié)果

3.2.4 ELISA鑒定用IDEXX的禽偏肺病毒試劑盒檢測病雞的血清樣品，陽性值為0．306，陰性值為0.14，待檢血清值為0．5，結(jié)果顯示，血清中親偏肺病毒的抗體很高。

4 分析與討論

雞傳染性鼻炎和禽偏肺病毒感染是近期我國養(yǎng)雞場常見的兩種傳染病。病原體分別是副雞禽桿菌和禽偏肺病毒。單獨(dú)感染都能引起雞只的眼瞼腫脹，呼吸道癥狀，繼而導(dǎo)致采食量減少，產(chǎn)蛋下降等相似的臨床表現(xiàn)。根據(jù)雞場獸醫(yī)介紹，該雞群進(jìn)行了馬立克、新城疫、傳染性囊病等常見疫病的疫苗免疫，沒有接種過雞傳染性鼻炎、支原體或偏肺病毒等相關(guān)疫苗。跟蹤調(diào)查結(jié)果顯示，新城疫，傳染性囊病免疫抗體水平較高?，F(xiàn)場的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)密度不是很大，雞舍通風(fēng)良好，但病雞癥狀表現(xiàn)得特別嚴(yán)重，單側(cè)或雙側(cè)眼瞼腫脹致盲。剖檢還發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)蛋雞輸卵管萎縮，或卵黃性腹膜炎。綜合發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變，我們初步懷疑是雞傳染性鼻炎。為進(jìn)一步確診，我們開展了實驗室診斷工作。分離鑒定出A型副雞禽桿菌，診斷為副雞禽桿菌。通過ELISA抗體檢測，發(fā)現(xiàn)禽偏肺病毒血清抗體呈陽性，進(jìn)一步的PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)樣品中含有C型偏肺病毒的核酸，綜合診斷為副雞禽桿菌和禽偏肺病毒的混合感染，但不排除還有其他病原體的共同感染。

5 治療措施

隔離病雞，病死雞銷毀進(jìn)行無害化處理。同時對全群雞只每羽肌肉注射10 000 IU頭孢氨芐;以慶大霉素飲水，連用3 d。對禽舍及飼養(yǎng)用具用0．1%百毒殺溶液進(jìn)行徹底的消毒處理;場內(nèi)健康雞與其他雞群緊急免疫雞傳染性鼻炎疫苗和偏肺病毒疫苗。經(jīng)治療，病情迅速得到控制。

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S855.1+2

B

0529-6005(2017)06-0056-03

2016-06-20

國家自然科學(xué)基金項目(31272558);農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(201303044);北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新能力建設(shè)項目(KJCX20140410)

梅晨(1989-)，女，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)工作，E-mail:bjmeichen@sina．com

王宏俊，E-mail:whj_1209@163．com