汪洲，肖玲玲，馮玉枚，郭金玲，田毅紅，呂育財(cái)，龔大春

利用油菜秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的工藝優(yōu)化

汪洲1，肖玲玲2，馮玉枚1，郭金玲1，田毅紅1，呂育財(cái)1，*龔大春1

（1.三峽大學(xué)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443002；2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌443002）

通過對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量。首先，通過單因素試驗(yàn)確定麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比、料液比、（NH4）2SO4添加量、接種量、營(yíng)養(yǎng)液初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)β-葡萄糖苷酶的影響，再利用三因素三水平正交試驗(yàn)得到最佳工藝條件。結(jié)果表明，麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比6∶4，料液比1∶1.8，培養(yǎng)溫度25℃，（NH4）2SO4添加量3%，接種量5%，營(yíng)養(yǎng)液初始pH值4.7，培養(yǎng)時(shí)間4 d；經(jīng)優(yōu)化后，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶平均酶活達(dá)127.4 U/g，比優(yōu)化前提高了50%。

固態(tài)發(fā)酵；β-葡萄糖苷酶；油菜秸稈

0 引言

植物纖維素是地球上最豐富的可再生資源，我國(guó)每年農(nóng)作物秸稈高達(dá)7×108t之多，有效利用農(nóng)作物秸稈這巨大的可再生資源，將在人類的能源、糧食和環(huán)境等問題中起到重大的作用，在可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略中占有重要的地位[1]。

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系中一種重要的水解酶，是高效利用廢棄物秸稈的關(guān)鍵酶之一[2]。β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)目前主要有固體發(fā)酵法、深層液體發(fā)酵法。就發(fā)酵方法而言，液體深層發(fā)酵自動(dòng)化程度高，容易控制，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[3-4]。但是，液體發(fā)酵纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)基需要經(jīng)過較為細(xì)致的加工，培養(yǎng)基中原料的允許濃度較低，致使產(chǎn)物濃度不能很高且產(chǎn)生大量的廢水。固態(tài)發(fā)酵雖機(jī)械化程度低、產(chǎn)品不穩(wěn)定、重復(fù)性差、但其操作工序簡(jiǎn)化、產(chǎn)物濃度高、節(jié)約能耗，沒有大量的廢水產(chǎn)生[5]。且固態(tài)發(fā)酵纖維素酶使用的原料不必經(jīng)過復(fù)雜的加工，在發(fā)酵過程中，糖化和發(fā)酵過程同步進(jìn)行，可使微生物保持自然界中的生長(zhǎng)狀態(tài)，模擬自然的生長(zhǎng)環(huán)境[6-7]。所以，以黑曲霉固態(tài)發(fā)酵秸稈為研究對(duì)象，采用自主發(fā)明的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)裝置，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期得到最佳的β-葡萄糖苷酶固態(tài)發(fā)酵工藝，提供工藝的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger），三峽大學(xué)生物催化宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；水楊素，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BPC-250F型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；UV-1100型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；XFLS-50MA型滅菌鍋，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；SW-CT-1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；AR2140型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；FW177型中草藥粉碎機(jī)。

1.2 培養(yǎng)基的配制

（1）種子培養(yǎng)基。由KH2PO40.5%，（NH4）2SO41%，MgSO4·7H2O 0.1%，葡萄糖6%配制而成。

（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基。①營(yíng)養(yǎng)液：MgSO40.2%，（NH4）2SO42%，F(xiàn)eSO40.01%，KH2PO40.2%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.1%，Co2+0.01%，羧甲基纖維素鈉0.1%，吐溫80 0.2%，聚乙二醇4000 1%，聚乙二醇6000 0.14%；②固體培養(yǎng)基：麥麩與40目油菜秸稈粉質(zhì)量比6∶4。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵方法

將活化的黑曲霉斜面種子，用無菌水沖洗，制成濃度為108個(gè)/mL的孢子懸浮液，按2%的接種量接入種子培養(yǎng)基，于28℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，然后按10%的接種量接入到固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，于30℃，濕度90%條件下恒溫培養(yǎng)44 d。

1.3.2 粗酶液的制備

將發(fā)酵所得固體酶曲按1∶10的料液比用HAc-NaAc緩沖液浸泡，攪拌10min后，再浸泡2 h，紗布過濾，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心，上清液即為粗酶液。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶酶活定義及測(cè)定方法

β-葡萄糖苷酶酶活力單位的定義：在50℃，pH值4.8的條件下，每1min從質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的水楊苷溶液中釋放1μmoL還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位U。

β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定方法，采用纖維素酶制劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

（1）麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比的確定。麩皮∶油菜秸稈粉質(zhì)量比分別以1∶4，2∶3，3∶3，3∶2，4∶1，在相同條件下恒溫培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

（2）最佳料液比的確定。分別以1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5的料液比，在相同條件下恒溫培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

（3）最佳（NH4）2SO4添加量的確定。培養(yǎng)基中（NH4）2SO4添加量分別以0.5%，0.8%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，在相同條件下恒溫培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

（4）最佳接種量的確定。分別以6%，8%，10%， 12%，14%的接種量，在相同條件下恒溫培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

（5）營(yíng)養(yǎng)液最適初始pH值的確定。將營(yíng)養(yǎng)液初始pH值分別調(diào)至3，4，5，6，7，在相同條件下恒溫培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

（6）最佳培養(yǎng)溫度的確定。培養(yǎng)溫度分別為25，30，35，40℃，在相同條件下恒溫培養(yǎng)4 d，測(cè)定酶活。

（7）最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定。以相同培養(yǎng)基和相同接種量在相同條件下分別培養(yǎng)4，5，6，7 d，測(cè)定酶活。

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定β-葡萄糖苷酶主要影響因素，選取3個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

β-葡萄糖苷酶主要影響因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交設(shè)計(jì)見表2。

表1 β-葡萄糖苷酶主要影響因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交設(shè)計(jì)

通過正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，得出最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

不同麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比對(duì)酶活影響見圖1，不同料液比對(duì)酶活影響見圖2，不同營(yíng)養(yǎng)液初始pH值對(duì)酶活影響見圖3，不同接種量對(duì)酶活影響見圖4，不同（NH4）2SO4添加量對(duì)酶活影響見圖5，不同培養(yǎng)溫度對(duì)酶活影響見圖6，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活影響見圖7。

按照1.4的方法，利用油菜秸稈對(duì)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件中的麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比、料液比、（NH4）2SO4添加量、接種量、營(yíng)養(yǎng)液初始pH值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的單因素試驗(yàn)優(yōu)化。經(jīng)分析得，麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比6∶4，料液比1∶2，（NH4）2SO4添加量1%，接種量8%，營(yíng)養(yǎng)液初始pH值4.0，培養(yǎng)溫度30℃和培養(yǎng)時(shí)間5 d，酶活為85 U/g。

圖1 不同麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比對(duì)酶活影響

圖2 不同料液比對(duì)酶活影響

圖3 不同營(yíng)養(yǎng)液初始pH值對(duì)酶活影響

圖4 不同接種量對(duì)酶活影響

圖5 不同（NH4）2SO4添加量對(duì)酶活影響

2.2 正交試驗(yàn)及分析

圖6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)酶活影響

圖7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活影響

通過單因素試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，料液比、培養(yǎng)溫度、麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活的影響較大，在（NH4）2SO4添加量4%，接種量8%，營(yíng)養(yǎng)液初始pH值4.7，培養(yǎng)時(shí)間5 d不變的條件下，選取如表2的試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比非常重要，為顯著影響因素。從均值可以看出，料液比1∶1.8，培養(yǎng)溫度25℃，麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比6∶4，發(fā)酵得到的β-葡萄糖苷酶酶活最高。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過以上試驗(yàn)得出的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳培養(yǎng)條件為麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比6∶4，料液比1∶1.8，培養(yǎng)溫度25℃，（NH4）2SO4

添加量3%，接種量5%，營(yíng)養(yǎng)液初始pH值4.7，培養(yǎng)時(shí)間4 d。做5組平行試驗(yàn)，得到的酶活結(jié)果，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可行。

驗(yàn)證試驗(yàn)見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

在單因素所得結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。從7個(gè)因素中篩選出3個(gè)主要影響因素，即麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比、料液比、培養(yǎng)溫度。通過正交試驗(yàn)得出最佳培養(yǎng)條件為麩皮與油菜秸稈粉質(zhì)量比6∶4，料液比1∶1.8，培養(yǎng)溫度25℃，（NH4）2SO4添加量3%，接種量5%，營(yíng)養(yǎng)液初始pH值4.7，培養(yǎng)時(shí)間4 d。優(yōu)化后，固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)酶的平均酶活達(dá)127.4 U/g，提高了50%。由此可見，試驗(yàn)為油菜秸稈資源化利用提供了重要基礎(chǔ)。

[1]孫世榮，郭祎，岳金權(quán).我國(guó)稻草資源化利用現(xiàn)狀及其評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2015（17）：20-23.

[2]龔大春，馮玉枚，郭金玲，等.一種基于循環(huán)水溫度控制的固態(tài)發(fā)酵裝置：中國(guó)湖北，CN204676083U[P]. 2015-09-30.

[3]閆玉玲，袁敬緯，李杰，等.纖維素酶的制備工藝及其商業(yè)化現(xiàn)狀研究[J].當(dāng)代化工，2015（5）：988-990，994.

[4]賴玉城.產(chǎn)多酶體系混菌固態(tài)發(fā)酵酒糟生產(chǎn)蛋白飼料[D].福建：福建師范大學(xué)，2014.

[5]張輝，張文會(huì)，孫中強(qiáng).響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉HQ-1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的固體發(fā)酵條件[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（11）：188-192.

[6]葛龍，趙艷，章亭洲.固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的特點(diǎn)與應(yīng)用[J].飼料與畜牧，2010（8）：54-56.

[7]汪彬彬，車振明.Plackett-Burman和Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化根霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J].食品科技，2011（5）：41-45.◇

Optimization of Process for Productionβ-glucosidase from Rape Straw

WANG Zhou1，XIAO lingling2，F(xiàn)ENG Yumei1，GUO Jinling1，TIAN Yihong1，LV Yucai1，*GONG Dachun1
（1.Key Lab of Biocatalysis，China Three Gorges University，Yichang，Hubei443002，China；2.Hubei Three Gorges Polytechnic，Yichang，Hubei443002，China）

The production ability ofβ-glucosidase by solid state fermentation from rape straw is improved by the optimization of process.The effect of the ratio between the rape straw and bran，the ratio between the solid component and water，the temperature，the contain amountof（NH4）2SO4，the inoculum concentration，the initial pH，the fermentation time on theβ-glucosidase production is studied.The optimum conditions are obtained by the orthogonal design experiment of three factors and three levels.The results showed that the optimum conditions are the ratio 6∶4 between bran and rape straw，and the ratio 1∶1.8 between the solid and the water，the temperature 25℃，（NH4）2SO43%，the inoculum concentration 5%，the initial pH 4.7 for 4 dayswith 127.4 U/gβ-glucosidase activity，increasing 50%than before.

solid-state fementation；β-glucosidase；rape straw

S816.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.037

1671-9646（2017）06b-0026-03

2017-05-20

宜昌市科技攻關(guān)項(xiàng)目“纖維素糖化制備微生物柴油的工藝研究”（A15-301-b04）。

汪洲（1989—），男，在讀碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：龔大春（1967—），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸镉N、發(fā)酵及新型酶制劑。