沈小鋼，郭志義，龐明輝，侯能易

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院胃腸外科，成都 610072）

Caspase-9在胃間質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)的臨床病理學(xué)意義

沈小鋼*，郭志義，龐明輝，侯能易

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院胃腸外科，成都 610072）

目的了解caspase-9在胃間質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)108例胃間質(zhì)瘤患者的腫瘤組織和胃壁正常組織中caspase-9 mRNA的表達(dá)；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。通過(guò)卡方檢驗(yàn)判斷caspase-9表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果Caspase-9 mRNA在胃間質(zhì)瘤組織的表達(dá)較正常胃壁組織低，且無(wú)論是mRNA還是蛋白水平，caspase-9表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤的核分裂象均密切相關(guān)，caspase-9表達(dá)下調(diào)的患者核分裂象高的可能性更大。結(jié)論Caspase-9在胃間質(zhì)瘤中低表達(dá)，且表達(dá)下調(diào)的腫瘤的核分裂象更高，提示可能與胃間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。

Caspase-9；caspase-3；胃間質(zhì)瘤；凋亡；核分裂象

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor, GIST）作為診斷術(shù)語(yǔ)最早使用于1983年，雖然僅占胃腸道惡性腫瘤的1%～3%，但依然是胃腸道最為常見(jiàn)的間葉源性腫瘤，發(fā)病率為6.5/百萬(wàn)人～14.5/百萬(wàn)人[1]。對(duì)胃間質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)直到進(jìn)入分子生物學(xué)水平才進(jìn)入新的階段，尤其是對(duì)KIT基因的研究奠定了胃間質(zhì)瘤的診斷基礎(chǔ)[2]，為C-kit免疫組織化學(xué)染色診斷胃間質(zhì)瘤奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的意義[3]。細(xì)胞凋亡的調(diào)控與caspase的半胱酰胺天冬氨酸特性蛋白酶家族關(guān)系極為密切。有3條不同的通路參與凋亡的調(diào)控，分別為：死亡受體通路、線粒體通路及顆粒蛋白酶B通路。根據(jù)在凋亡通路中作用的不同，caspase家族可以分為凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者兩個(gè)亞族。Caspase-9是線粒體通路中的啟動(dòng)者，在凋亡的調(diào)控中扮演著重要的作用[4,5]。大量的研究表明，部分腫瘤的發(fā)生為正常凋亡機(jī)制被抑制所致[6,7]。而目前我們對(duì)胃間質(zhì)瘤與凋亡的關(guān)系還知之甚少，更是缺乏caspase-9與胃間質(zhì)瘤關(guān)系的研究。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)caspase-9在胃間質(zhì)瘤的表達(dá)，并分析其表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，以探討caspase-9在胃間質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料和方法

1 標(biāo)本來(lái)源

共有108例在四川省人民醫(yī)院胃腸外科行手術(shù)治療的胃間質(zhì)瘤病人納入了該研究。該研究符合四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并通過(guò)該委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。所有病員術(shù)前未行格列衛(wèi) （Gleevec）治療，其中74例患者行腹腔鏡手術(shù)，34例行開(kāi)腹手術(shù)。所有腫瘤均采用局部或楔形切除，切緣超過(guò)腫瘤邊界至少2厘米。術(shù)后有105例經(jīng)常規(guī)病理及CD117和DOG1免疫組化診斷為胃間質(zhì)瘤，另外3例CD117及DOG1均陰性的病員經(jīng)過(guò)對(duì)c-KIT及PDGFRA基因檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)有熱點(diǎn)位點(diǎn)突變最終診斷為胃間質(zhì)瘤。采用2013版中國(guó)胃腸道間質(zhì)瘤病理診斷治療共識(shí)推薦的NIH2008年改良版對(duì)腫瘤的危險(xiǎn)度進(jìn)行分級(jí)（表1）。年齡在21-83歲，中位年齡51歲，56名男性和52名女性患者。腫瘤標(biāo)本離體后第一時(shí)間測(cè)量并記錄腫瘤最大徑，一半腫瘤標(biāo)本以福爾馬林固定石蠟包埋制成組織塊行病理學(xué)檢查，另一半腫瘤標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的標(biāo)本切緣處正常胃組織則立即投入液氮中暫存并隨后轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱備用。

表1 NIH 2008胃間質(zhì)瘤危險(xiǎn)度分級(jí)Tab. 1 Risk grading of gastric stromal tumor (NIH 2008)

2 引物和探針

本實(shí)驗(yàn)選取GADPH作為內(nèi)參基因，利用Taqman Gene Expression Assays軟件設(shè)計(jì)針對(duì)caspase-9和 GADPH的特異性引物和探針，由中國(guó)大連的Takara生物公司合成（表2），并通過(guò)NCBI提供的BLAST程序驗(yàn)證了核酸序列的特異性。

表2 caspase-9與GADPH的引物及探針序列Tab. 2 Primers and probes of caspase-9 and GADPH

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用Trizol試劑（Invitrogen）按照說(shuō)明書(shū)的方法對(duì)總RNA進(jìn)行提取。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量260nm和280nm下的吸光度并進(jìn)行定量，計(jì)算D（260）/D（280），所有標(biāo)本的比值要求在1.8～2.0之間。通過(guò)第一鏈合成試劑盒（Fermentas）將2μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用Taqman探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)caspase-9基因表達(dá)做相對(duì)定量檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)在iCycler iQ系統(tǒng) （美國(guó)BIO-RAD公司）上完成。所用的反應(yīng)條件如下：預(yù)變性溫度 94℃：2 min，解鏈溫度94℃ ：30s，退火溫度53℃：30s，復(fù)性溫度72℃ ：20s。共經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，每一個(gè)標(biāo)本都會(huì)得到一Ct值，它是熒光信號(hào)超過(guò)閾值所需的循環(huán)數(shù)。PCR擴(kuò)增效率采用公式E=10-1/slope計(jì)算[8]。Caspase-9的相對(duì)表達(dá)率R的計(jì)算基于PCR擴(kuò)增效率E以及樣本和對(duì)照的差（ΔCt）。R =（Ecaspase-9）ΔCtcaspase-9 (normal – tumor)/ （EGADPH）ΔCtGADPH(normal–tumor)[9]。R＜1時(shí)表明caspase-9在腫瘤組織中相對(duì)于正常胃壁組織低表達(dá)。

4 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷

組織塊行常規(guī)連續(xù)4μm切片，貼于涂被多聚賴氨酸的載玻片上。 組織切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟后浸泡于梯度乙醇中水化，3%過(guò)氧化氫－甲醇溶液室溫孵育30min。采用微波抗原修復(fù)，滴加2%非免疫性山羊血清，室溫封閉30m in；滴加鼠抗人caspase-9抗體（1:200；Chem icon） ，4°C 過(guò)夜，PBS 沖洗；滴加Envision二抗（GeneTch），37°C孵育30m in，PBS沖洗；DAB顯色約1m in，去離子水終止顯色；蘇木素復(fù)染30s；鹽酸酒精分化5s；自來(lái)水沖洗30m in返藍(lán)；梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。以已知強(qiáng)陽(yáng)性染色的組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定采用二級(jí)計(jì)分法。染色強(qiáng)度分級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，黃色或深黃色為2分，褐色或棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：≤5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。兩者計(jì)分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，0～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。

5 統(tǒng)計(jì)分析

Caspase-9在胃間質(zhì)瘤及胃壁正常組織中的表達(dá)變化采用基于隨機(jī)化檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件REST（relative expression software tool）進(jìn)行分析。采用SPSS16.0軟件基于卡方或Fisher確切概率法對(duì)caspase-9的表達(dá)變化與臨床病理學(xué)指標(biāo)間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05被視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胃間質(zhì)瘤的臨床病理特征

在所有的108例患者中，腫瘤位于胃底的有21例，胃體的68例，胃竇的19例；腫瘤最大直徑小于5 cm的有70例，大于5cm的有38例；核分裂象少于5/50HPF的71例，多于5/50HPF的37例。術(shù)中未發(fā)生腫瘤破裂，危險(xiǎn)度分級(jí)判定為極低危的16例，低危的48例，中危的28例，高危的16例。

2 Caspase-9 mRNA在胃間質(zhì)瘤和胃壁正常組織的表達(dá)變化

Caspase-9 mRNA在所有標(biāo)本中均能被檢測(cè)。在40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中未發(fā)現(xiàn)引物二聚體。將5個(gè)等比例濃度梯度的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增后得到的Ct值，輸入REST軟件則獲得本反應(yīng)體系下PCR擴(kuò)增效率。在所有的108例配對(duì)的樣本中，82例R＜1，表明caspase-9在這些病例的胃間質(zhì)瘤組織中相對(duì)于正常胃壁組織低表達(dá)。REST軟件的分析結(jié)果顯示caspase-9在胃正常組織的表達(dá)強(qiáng)度是其在胃間質(zhì)瘤組織中表達(dá)強(qiáng)度的5.480倍（P =0.001）（表3）。

表3 REST軟件對(duì)108例胃間質(zhì)瘤和其對(duì)應(yīng)正常胃壁caspase-9表達(dá)變化的輸出結(jié)果Tab. 3 Output of random ization test by REST software for changes in caspase-9 expression in 108 gastric stromal tumor and corresponding normal gastric wall

3 Caspase-9 mRNA表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

Caspase-9 mRNA表達(dá)變化與臨床病理學(xué)指標(biāo)間關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示caspase-9 mRNA表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤的核分裂象密切相關(guān)（P=0.020），caspase-9 mRNA低表達(dá)患者核分裂象＞5/50HPF的概率為40.2%，明顯高于caspase-9 mRNA高表達(dá)患者的15.4%；caspase-9 mRNA表達(dá)變化與年齡、性別、腫瘤部位均無(wú)相關(guān)性；雖然caspase-9 mRNA表達(dá)變化與腫瘤大小及危險(xiǎn)度分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性，但低表達(dá)的患者中腫瘤直徑超過(guò)5厘米的病例為39.0%，高于高表達(dá)的患者的23.1%；此外，caspase-9 mRNA表達(dá)越低的患者，其腫瘤危險(xiǎn)度分級(jí)也越高（表4）。

表4 caspase-9 m RNA表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab. 4 Relationship between caspase-9 m RNA level and the clinicopathological features of gastric stromal tumor

4 Caspase-9蛋白表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

Caspase-9主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1）。在所有的108例胃間質(zhì)瘤組織中，88例組織的caspase-9判定為低表達(dá)。進(jìn)一步的分析表明， caspase-9表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤的核分裂象密切相關(guān)，而與其他指標(biāo)均無(wú)明顯相關(guān)性（表5）。即使沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但依然能發(fā)現(xiàn)caspase-9低表達(dá)的胃間質(zhì)瘤瘤體更大，危險(xiǎn)度分級(jí)更高的趨勢(shì)。

表5 Caspase-9蛋白表達(dá)變化與胃間質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab. 5 Relationship between caspase-9 level and the clinicopathological features of gastric stromal tumor

圖1 Caspase-9在胃間質(zhì)瘤組織中的免疫組織化學(xué)表達(dá)。A，低表達(dá)病例；B，高表達(dá)病例；比例尺，100μmFig. 1 Immunohistochem ical expression of caspase-9 in gastric stromal tumor. A, low expression; B, high expression; scale bar, 100μm

討 論

胃腸道間質(zhì)瘤被認(rèn)為起源于cajal細(xì)胞（interstitial cell of Cajal,ICC）同源的葉間干細(xì)胞，ICC細(xì)胞是胃腸道自主神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，是胃腸道蠕動(dòng)的始動(dòng)細(xì)胞[10]。胃腸道間質(zhì)瘤最好發(fā)于胃，約占總病例的70%，20%發(fā)生于小腸，不到10%來(lái)源于食道。約85%的胃腸道間質(zhì)瘤伴隨有KIT基因的突變，10%有PDGFRA基因突變[11,12]。上述KIT基因及PDGFRA基因在胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的作用，并成為胃間質(zhì)瘤靶向治療的目標(biāo)。

惡性腫瘤的重要特征之一為細(xì)胞的惡性增殖即失去正常的凋亡能力。凋亡的缺陷賦予腫瘤細(xì)胞能夠脫離細(xì)胞外基質(zhì)的生存能力，對(duì)凋亡抵抗的腫瘤細(xì)胞也被證明能粘附并生長(zhǎng)于遠(yuǎn)處的毛細(xì)血管床[13,14]。這些都提示凋亡可能參與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前，手術(shù)結(jié)合靶向治療依然是胃間質(zhì)瘤病人治療的最重要手段，但依然有超過(guò)50%的病人最終出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡[15]。從細(xì)胞凋亡著手研究其與胃間質(zhì)瘤的關(guān)系將有助于我們對(duì)胃間質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展更好的理解并可能有益于胃間質(zhì)瘤的治療。

Caspase-9是線粒體凋亡調(diào)控通路的啟動(dòng)者，在癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[16]。在很多腫瘤中，caspase-9的激活是抗腫瘤藥誘導(dǎo)凋亡的上游信號(hào)事件[17-19]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)caspase-9在結(jié)直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[20]。還有大量的研究發(fā)現(xiàn)caspase-9在多種癌組織中低表達(dá)[21-23]。不同于癌，胃間質(zhì)瘤為非上皮來(lái)源的惡性腫瘤，是否caspase-9也與胃間質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)尚不明確。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)108例胃間質(zhì)瘤患者的腫瘤組織及正常胃組織中caspase-9的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在胃間質(zhì)瘤中低表達(dá)。此前也有報(bào)道caspase-9在骨肉瘤組織中低表達(dá)。這說(shuō)明caspase-9在上皮及非上皮來(lái)源的眾多惡性腫瘤中表達(dá)具有一致性。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)caspase-9表達(dá)變化與腫瘤的核分裂象密切相關(guān)。Caspase-9表達(dá)下調(diào)的胃間質(zhì)瘤其核分裂象越高，表明腫瘤的惡性程度越高。而陳金元研究了caspase-3與胃間質(zhì)瘤的關(guān)系后雖然發(fā)現(xiàn)caspase-3在胃間質(zhì)瘤中低表達(dá)，卻并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其與胃間質(zhì)瘤的核分裂象以及其他的臨床病理特征的相關(guān)性[24]。Caspase-3不僅是caspase-9介導(dǎo)的線粒體調(diào)控通路的下游的靶基因，同時(shí)也是死亡受體通路及顆粒蛋白酶B通路的共同靶基因。還有研究表明凋亡抑制蛋白livin在胃腸道間質(zhì)瘤中高表達(dá)，而促凋亡因子smac高表達(dá)[25]。我們推測(cè)凋亡機(jī)制的缺陷對(duì)胃間質(zhì)瘤的發(fā)生具有重要意義，多個(gè)凋亡通路共同參與了胃間質(zhì)瘤的發(fā)展。

我們的研究發(fā)現(xiàn)caspase-9在胃間質(zhì)瘤中低表達(dá)，且與腫瘤的核分裂象密切相關(guān)，這表明caspase-9與胃間質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)。既然多個(gè)研究表明胃間質(zhì)瘤中凋亡機(jī)制被抑制，是否上調(diào)caspase-9誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡可以用于治療胃間質(zhì)瘤將有待更多的研究來(lái)回答。

致謝

感謝我院規(guī)范化培訓(xùn)學(xué)員黃科在標(biāo)本采集過(guò)程中所做的工作，感謝病理科劉翔醫(yī)生對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果判讀的分析指導(dǎo)。該研究受到了四川省人民醫(yī)院博士課題基金的支助

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Clinical pathological signif cance of caspase-9 down-regulation in gastric stromal tumor

Shen Xiaogang*, Guo Zhiyi, Pang M inghui, Hou Nengyi
（Department of Gastrointestinal Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences ＆Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China）

ObjectiveTo investigate the expression of caspase-9 in gastric stromal tumor and its relationship w ith clinicopathological features. MethodsQuantitative RT-PCR and immunohistochemistry were applied respectively to detect the levels of caspase-9 mRNA and protein in the gastric stromal tumor and corresponding normal gastric tissue of 108 patients. The clinicopathological signif cance of caspase-9 expression was analyzed by Chi-square test.ResultsCaspase-9 mRNA level was lower in the tumorous tissue than in normal tissue. The changes in both the levels of caspase-9 mRNA and protein were closely related to the m itotic fgures of gastric stromal tumor. Patients w ith down-regulated caspase-9 were more likely to have a high m itotic fgure.ConclusionCaspase-9 is down-regulated in gastric stromal tumor and this is correlated w ith high m itotic fgures, suggesting that caspase-9 plays an important role in the pathogenesis and prognosis of gastric stromal tumor.

Caspase-9; caspase-3; gastric stromal tumor; apoptosis; m itotic fgure

R573.9

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.008

2017-01-13

2017-05-22

四川省人民醫(yī)院博士基金（30305030584）

沈小剛，男（1983年），漢族，主治醫(yī)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：shenxiaogangrr@163.com