宋魏，張建波，馬杰，于慶凱*

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1病理科，2分子病理科，鄭州450000）

骨肉瘤患者外周血單個核細(xì)胞m icroRNA-21與骨肉瘤組織中K i-67表達水平檢測及其臨床價值

宋魏1，張建波2，馬杰1，于慶凱1*

（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1病理科，2分子病理科，鄭州450000）

目的探討外周血單個核細(xì)胞中m icroRNA-21（m iR-21）水平和組織中Ki-67表達在骨肉瘤發(fā)展中的臨床價值。方法采用RT-qPCR法檢測120例骨肉瘤患者、80例骨軟骨瘤和70例正常健康人群miR-21的表達水平，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Ki-67表達，采用受試者工作特征曲線（ROC）分析m iR-21對骨肉瘤的診斷價值。結(jié)果m iR-21在骨肉瘤患者外周血中的表達顯著高于正常人群，miR-21表達與臨床分期、術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、性別、病理類型、病變部位均無關(guān)。m iR-21的ROC曲線下面積為0.858，敏感度和特異度分別為91.89%和79.61%。Ki-67在骨肉瘤組織中的免疫組織化學(xué)表達水平明顯高于骨軟骨瘤和正常人群組織。結(jié)論miR-21和Ki-67的表達水平與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，外周血miR-21水平和Ki-67表達檢測可增強對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展的預(yù)測能力。

microRNA-21；Ki-67；骨肉瘤；骨軟骨瘤；外周血單個核細(xì)胞；臨床分期；轉(zhuǎn)移

骨肉瘤是一種惡性程度高的原發(fā)性腫瘤，其特點是癌細(xì)胞直接形成骨樣組織。骨肉瘤大多發(fā)生在10～25歲人群，男性發(fā)病率高于女性；其發(fā)病部位多處于骨端，偶爾發(fā)生在骨干或骨骺[1]。即使現(xiàn)在治療方式增多，如化療、保守治療、截肢術(shù)、其他治療等，但其存活率或修復(fù)率仍是不理想[2]。由于骨肉瘤發(fā)病率的成倍增加，患者一般可以活15個月至5年，常伴隨引發(fā)的并發(fā)癥有心臟病、肺病、糖尿病、和病理骨折；術(shù)后極易出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，即使截肢，患者3～5年存活率僅為5%～20%，預(yù)后非常不理想[3]。外周血單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，多用密度梯度離心法提取需要成分[4]。M icroRNAs(miRNAs)是一類存在于真核生物的非常常見和廣泛的非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)具有多種調(diào)節(jié)作用，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、以及程序性死亡等[5,6]；其通過參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控，提供了新的基因表現(xiàn)調(diào)控方式。既往研究已證實，m iRNAs在研究疾病發(fā)病機制中的重要作用[7,8]和優(yōu)勢，其性質(zhì)穩(wěn)定，可抗熱、抗酸堿等物理化學(xué)變化[9]。m iRNAs與腫瘤相關(guān)進程有著密切聯(lián)系，起著促癌或者抑癌基因的作用，有望成為早期腫瘤診斷的分子標(biāo)識物[10,11]。m icroRNA-21（m iR-21）是一種在腫瘤癌癥中有著高表達的小RNA分子。人類m iR-21定位于染色體17q23.2區(qū)，常起著促癌作用[12,13]。直接抽取外周血獲得實驗標(biāo)本，操作簡便、快速且無侵[14]；同時鑒于骨肉瘤的惡性程度和不良預(yù)后，研究外周血單個核細(xì)胞中m iR-21在骨肉瘤臨床診斷中有重要價值。本研究通過對外周血單個核細(xì)胞進行分離檢測的方法，分析m iR-21在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其對骨肉瘤的診斷價值。

材料與方法

1 研究對象

在2011年12月至2013年12月期間，收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的120例原發(fā)性骨肉瘤患者手術(shù)切除的骨肉瘤標(biāo)本。所有病例均經(jīng)臨床病理和影像學(xué)檢測確診，并經(jīng)HE染色進一步驗證骨肉瘤，均接受手術(shù)治療。本研究病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①入院確診，原發(fā)性骨肉瘤患者；②無任何針對腫瘤細(xì)胞的治療史；③病變部位集中，為四肢骨骼。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性骨肉瘤，或有嚴(yán)重疾病史，包括重要臟器功能衰竭，代謝性骨病，良惡性腫瘤等等；②接受既往腫瘤治療方案，或正在接受治療者；③婦女正在生育或哺乳期間；④患者臨床資料缺失，無法配合完成隨訪者。120例骨肉瘤患者中，男性78例，女性42例，年齡9～48歲，中位年齡20歲，男女比例1.86:1。病理分型依據(jù)WHO骨肉瘤分類[15]，共分為2類，其中普通型骨肉瘤納入患者92例，其他類型28例。按照Ennecking外科分期法[16]，臨床分類為Ⅰ期18例，ⅡA期33例，ⅡB期42例，Ⅲ期27例。病變部位：脛骨上端44例，股骨下端62例，其他部位14例。另外，91例骨肉瘤患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中肺轉(zhuǎn)移患者58例。收集80例骨軟骨瘤標(biāo)本作為對照研究，選自本院病理科同期手術(shù)切除的骨軟骨瘤標(biāo)本。其中男性52例，女性28例，年齡9～50歲，中位年齡20歲，男女比例1.86:1。收集70例同期本院來源于非腫瘤患者的新鮮正常骨組織標(biāo)本和外周血標(biāo)本作為健康對照，男性55例，女性25例，年齡8～50歲，中位年齡19歲，男女比例1.80:1。病例組和對照組年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 血液樣本制備及總RNA提取

用EDTA-K2 抗凝管采集所有的研究對象外周血3～5m l，1600g離心10m in后，將上層血漿小心轉(zhuǎn)移到潔凈的離心管中，再以13300g離心10min，除去所有的細(xì)胞碎屑等污染物，吸取上層血漿于潔凈的離心管，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ?00μl血漿于1.5m l離心管中，75 ℃加熱5m in，42 ℃溫育1h。按照Invitrogen的Trizol 試劑盒說明書進行RNA提取，用NanoDrop 1000（Thermo Scientif c, America） 檢測RNA濃度，并讀取在260/280 nm處吸收值，此值介于1.8～2.0之間。將RNA保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3 實時熒光定量PCR檢測

依據(jù)RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明（TaKaRa 公司）建立本實驗所需的逆轉(zhuǎn)錄體系（總含量為20μl），將配制好的反應(yīng)試劑振蕩混勻后置于PCR 反應(yīng)儀（Step OneTM, APPlied Biosystems公司，美國），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄（37℃ 30m in，85 ℃15s），獲取合成cDNA模板。產(chǎn)物低溫（-20℃）保存?zhèn)溆?。隨后，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模版，進行PCR擴增。RT-qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10m in，95 ℃15s，60 ℃20s，72℃20s，40個循環(huán)(各基因的上下游引物如表1所示)。隨后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μl在1%瓊脂糖凝膠上電泳。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶，采用凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）對電泳凝膠圖譜進行觀察拍照，并保存電泳條帶類型，依據(jù)電泳后條帶亮度的強弱判斷表達量高低。熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20 μl:1.3μl cDNA模板，1μl m iR-21(U6)特異性引物，10μl TaqMan Universal PCRmaster M ix (ABI)，7.7μl H2O。所有反應(yīng)均設(shè)立3個復(fù)孔。記錄每個反應(yīng)管中標(biāo)本的CT值，實驗結(jié)果采用定量PCR中的相對定量法進行分析用2-△△Ct表示病例組織相對于健康對照組織相對表達量的變化倍數(shù)，其中ΔΔCt= (CTmiR-21－CTU6)病例組織－(CTmiR-21－CTU6)健康對照組織。SPSS 21.0統(tǒng)計軟件計算各組目的基因相對表達量并繪制柱狀圖。

表1 m iR-21及U6 的RT-qPCR引物Tab. 1 RT-qPCR primers of m iR-21 and U6

4 免疫組織化學(xué)染色

組織樣本收集后，用酒精（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）梯度脫水，二甲苯（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）透明，石蠟（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）包埋、切片。切片在烤箱中烤片1 h后浸入二甲苯脫蠟、酒精入水，pH6.0檸檬酸鹽緩沖液進行高壓抗原修復(fù)，隨后在室溫冷卻，PBS沖洗3次。加入鼠抗人Ki-67單克隆抗體（即用型；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）孵育過夜，PBS沖洗3次（2m in/次），生物素標(biāo)記的兔抗小鼠IgG（1:1000；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育37℃30m in，PBS沖洗，加DAB液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），蘇木素復(fù)染，反藍，梯度酒精脫水，最后進行二甲苯透明，以中性樹膠（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）封片，顯微鏡下觀察。實驗過程以PBS代替一抗作為空白對照。

結(jié)果判定：Ki-67陽性染色主要定位細(xì)胞核，選取任意5個高倍鏡視野，按所選視野陽性細(xì)胞占比計數(shù)，用平均值定義陽性細(xì)胞百分比為評定標(biāo)準(zhǔn)，以陽性細(xì)胞數(shù)＞25%定義陽性。同時，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0分析系統(tǒng)對Ki-67標(biāo)記的切片標(biāo)本隨機選取5個圖像，測定積分光密度，取平均值為相對表達量，以此作為進行Ki-67的定量分析。

5 統(tǒng)計學(xué)方法

m iR-21相對表達量及Ki-67積分光密度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，陽性表達率以及其他計數(shù)資料以百分比表示。使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對比分析（組間均數(shù)t檢驗，多組間方差分析）；應(yīng)用受試者工作曲線（ROC）分析m iR-21對骨肉瘤的診斷價值，并計算對應(yīng)曲線下面積，以及敏感度和特異度。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨肉瘤患者外周血單個核細(xì)胞中m iR-21水平增高

通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者、骨軟骨瘤患者及健康對照組外周血中miR-21相對表達量2-ΔΔCt分別為1.43±0.10、1.02±0.07和0.67±0.08，骨肉瘤患者外周血中m iR-21相對表達量顯著高于骨軟骨瘤組和健康對照組，且骨軟骨瘤組水平較健康對照組高（圖1）。

圖1 骨肉瘤和骨軟骨瘤患者與正常人外周血單個核細(xì)胞中m iR-21表達水平的PCR檢測。A，凝膠電泳檢測；B，定量PCR檢測結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析；*，0.01＜P＜ 0.05Fig. 1 PCR detection of the level of miR-21 in peripheral blood mononuclear cells in osteochondroma patients, osteochondroma patients and healthy controls. A, detection by gel electrophoresis; B, statistical analysis of qPCR results; *, 0.01＜P ＜ 0.05

2 m iR-21水平與臨床分期、術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)

m iR-21相對表達量與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系見表2。miR-21在有轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)患者中的相對表達量顯著高于無轉(zhuǎn)移患者，臨床分期IIB+III期患者m iR-21相對表達量亦顯著高于I+IIA 期患者，但m iR-21相對表達量的高低與骨肉瘤患者的年齡、性別、病理類型、病變部位無關(guān)。

表2 M iR-21相對表達量與骨肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系Tab. 2 The relationship between the relative expression of M iR-21 and the clinicopathological features of osteosarcoma

3 m iR-21在骨肉瘤診斷中的價值

以正常人群外周血m iR-21相對表達量為對照組，與骨肉瘤外周血m iR-21相對表達量進行ROC曲線分析（圖2），m iR-21的曲線下面積為0.858，95%可信區(qū)間（95%CI）為0.805～0.910（P ＜ 0.001），敏感度和特異度分別為91.89%和79.61%。

圖2 m iR-21表達診斷骨肉瘤的ROC曲線Fig. 2 ROC curve of miR-21 expression in the diagnosis of osteosarcoma

圖3 骨肉瘤（A）和骨軟骨瘤（B）組織與正常人（C）骨組織中Ki-67表達的免疫組織化學(xué)檢測。比例尺，20μmFig. 3 Immunohistochem ical detection of Ki-67 expression in (A) osteosarcoma, (B) osteochondroma and (C) normal bone tissue. Scale bar, 20μm

4 骨肉瘤中K i-67免疫反應(yīng)性增強

Ki-67陽性染色主要表達于細(xì)胞核中，細(xì)胞質(zhì)無明顯著色，其陽性出現(xiàn)黃色、棕褐色大小不等的顆粒分布并明顯高于背景著色為陽性（圖3）。在120例骨肉瘤組織中，Ki-67的陽性表達99例，陽性率為82.50%，其中強陽性(+++)表達為24例，中度陽性(++)表達為48例，弱陽性(+)表達有27例，陰性(-)表達21例。骨軟骨瘤組織中表達陽性率為32.50%，陽性表達26例，陰性表達54例。而在正常骨組織中，陽性表達為6例，陽性率為8.57%，其中僅6例為弱陽性，其余均為陰性表達。Ki-67在骨肉瘤組織中的表達明顯高于骨軟骨瘤和正常骨組織，骨軟骨瘤組織中的表達高于正常骨組織。

應(yīng)用Image-Pro Plus6.0分析系統(tǒng)對Ki-67免疫性強度分析顯示，骨肉瘤組織、骨軟骨瘤組織中及正常對照組織的積分光密度值分別為（38.21±6.23）、（35.55±5.40）和（27.96±4.68），骨肉瘤和骨軟骨瘤組織積分光密度值均高于正常對照骨組織，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(骨肉瘤vs.正常對照：t=13.15，P＜0.001；骨軟骨瘤vs.正常對照：t=10.62，P＜0.001)，且骨肉瘤組織的Ki-67積分光密度亦高于骨軟骨瘤組織，具有顯著性差異(t=3.226，P=0.015)（表3）。

表3 骨肉瘤和骨軟骨瘤組織與正常人骨組織中Ki-67表達的陽性率比較Tab. 3 Com parison of the positive rates of K i-67 expression in osteosarcoma, osteochondroma and normal bone tissue

討 論

骨肉瘤在原發(fā)性惡性腫瘤中發(fā)病率常位居首位，對患者生命質(zhì)量安全影響重大，需高度重視。在現(xiàn)有一系列治療方法之上，更多可以提前采取預(yù)防措施，普及相關(guān)的知識，少年若是發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)周圍無明顯外傷的疼痛時，早期出現(xiàn)持續(xù)性疼痛后，應(yīng)及時檢查預(yù)防[3,6]。同時，近年來m iRNAs在生命進程中扮演的角色逐漸凸顯，其在生物發(fā)育和生理活動中的調(diào)控功能也逐漸明朗，針對m iRNAs的研究成為當(dāng)前熱點之一。M iRNAs是在各類小分子RNA中基因調(diào)節(jié)功能最為明顯的一類，其在正常和病理樣本中水平差異明顯，不同臨床階段的同一檢測樣本，其表達也不同[9,11]，提示m iRNAs可作為疾病監(jiān)測指標(biāo)，也能為后期診療研究提供一定依據(jù)。現(xiàn)階段，針對骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移等其他并發(fā)癥，在原有的治療方式上，開展了免疫基因治療、反義基因治療、抑癌基因治療等新型方法[17]。而m iR-21在腫瘤中常起著促癌基因的作用[13]，因此，本研究通過探討分析納入研究對象外周血m iR-21表達水平和組織Ki-67表達與骨肉瘤的相關(guān)關(guān)系，對于骨肉瘤的臨床診療有很重大意義。

本研究采用密度梯度離心法對從研究對象采集的外周血單個核細(xì)胞進行分離，運用實時熒光定量PCR方法對m iR-21進行檢測分析[18]。實時熒光定量 PCR具有高度的特異性和敏感性及相對費用低的優(yōu)點，是包括m iRNAs在內(nèi)的核酸定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[19]。本實驗提示外周血m iR-21的表達水平與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，外周血單個核細(xì)胞中的m iR-21水平可作為骨肉瘤患者的診斷指標(biāo)。目前主要影響骨肉癌發(fā)病率的主要因素有p53和Rb抑癌基因異常、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活化蛋白-1、原癌基因、m iRNAs失調(diào)等；而在骨肉瘤轉(zhuǎn)移過程中，轉(zhuǎn)移和入侵腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤上分離，進入血流后，經(jīng)過轉(zhuǎn)染，從而形成轉(zhuǎn)移性骨肉瘤[20,21]。m iR-21作為一組非編碼RNA的組合，參與調(diào)控基因表達，并在多種腫瘤中扮演著促癌基因的作用。孫騰龍在研究中提到，在多發(fā)性骨髓癌（MM）中，m iR-21在MM患者中的表達水平要高于正常健對照組，與細(xì)胞增殖、化療和疾病預(yù)后治療有著密切聯(lián)系[22]。通過調(diào)節(jié)miR-21在骨肉瘤細(xì)胞中的表達水平來研究細(xì)胞的變化與miR-21的關(guān)系，上調(diào)m iR-21表達水平后，細(xì)胞生長增殖能力加強，而下調(diào)m iR-21表達水平后，細(xì)胞增殖能力受到抑制；在轉(zhuǎn)染m iR-21抑制劑后，發(fā)現(xiàn)其能抑制細(xì)胞增殖；進一步說明了m iR-21是骨肉瘤細(xì)胞侵襲的重要因子，m iR-21的失調(diào)是骨肉瘤發(fā)病因素之一[20,23]；吳夕在對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞（PTC）研究中提到，m iR-21在PTC組織中的表達遠(yuǎn)高于癌旁正常組織，轉(zhuǎn)染后的m iR-21細(xì)胞凋亡率明顯增加；吳子宴在研究中提到，轉(zhuǎn)染m iR-21后，細(xì)胞凋亡明顯增加，說明轉(zhuǎn)染后的m iR-21可有效抑制m iR-21的致癌作用，反之，說明m iR-21有促進癌細(xì)胞發(fā)散的作用，以上均表明外周血m iR-21與骨肉瘤的發(fā)生有著相關(guān)作用[12,24]。與此同時，以健康正常組為對照組，與骨肉瘤外周血m iR-21水平結(jié)果做ROC曲線分析，m iR-21曲線下面積為0.858,95%CI為0.805～0.910，關(guān)聯(lián)度高，表明在骨肉瘤中，m iR-21可以作為骨肉瘤患者的診斷指標(biāo)，呈現(xiàn)高表達的m iR-21常伴隨骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和較高的臨床分期，提示miR-21外周血水平的檢測可用于預(yù)判骨肉瘤的發(fā)展趨勢及臨床病理特征的嚴(yán)重程度。同時，為進一步確定影響骨肉瘤的重要生物標(biāo)記，我們關(guān)注了Ki-67表達在骨肉瘤中的變化。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示Ki-67陽性表達率有助于區(qū)分惡性骨肉瘤、良性骨軟骨瘤和正常人群，該結(jié)果提示作為細(xì)胞增殖相關(guān)抗原[25]，Ki-67的檢測有助于預(yù)測骨肉瘤發(fā)展。

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Detection for m icroRNA-21 level in peripheral blood mononuclear cells and K i-67 level in osteosarcoma tissue in osteosarcoma patients and analysis of the clinic signif cance

Song Wei1, Zhang Jianbo2, Ma Jie1, Yu Qingkai1*
(1Department of Pathology,2Department of Molecular Pathology, The Af liated Tumor Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo investigate the clinical signif cance of the level of microRNA-21 (miR-21) in peripheral blood mononuclear cells and tissue Ki-67 in the development of osteosarcoma.M ethodsRT-qPCR was performed to detect the expression of miR-21 in 120 cases of osteosarcoma, 80 cases of osteochondroma and 70 cases of normal healthy controls, the level of Ki-67 protein was detected by immunohistochem istry, and receiver operating characteristic curve (ROC) was used to analyze the value of m iR-21 in the diagnosis of osteosarcoma.ResultsThe level of miR-21 in peripheral blood was signif cantly higher in osteosarcoma patients than that in normal controls. Its expression was related to clinical staging, postoperative recurrence and metastasis, while not correlated w ith age, gender, pathological type and lesion location. The area under ROC curve of miR-21 was 0.858, the sensitivity and specif city were 91.89% and 79.61%, respectively. The immunohistochem ical expression of Ki-67 was signif cantly higher in osteosarcoma tissue than in osteochondroma and normal control tissue.ConclusionThe expression of miR-21 and Ki-67 is associated w ith the development of osteosarcoma, and detection of the level of m iR-21 in peripheral blood and Ki-67 expression can help to predict the occurrence and development of osteosarcoma.

M icroRNA-21; Ki-67; osteosarcoma; osteochondroma; peripheral blood mononuclear cells; clinical stage; metastasis

R738.1

ADOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.011

2017-01-21

2017-06-09

宋魏，女(1980)，漢族，主治醫(yī)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：medchang@126.com