錢亞芳++單樂天+++金紅婷+++谷滿倉

[摘要] 目的 建立補腎活血方親脂性組分的氣相色譜測定方法，研究該組分誘導成骨細胞分化的活性。 方法 采用超臨界流體萃取補腎活血方中親脂性組分SFEⅠ和SFEⅡ，氣相色譜法測定其中亞油酸和油酸含量；研究SFEⅠ和SFEⅡ含藥血清誘導小鼠成骨細胞MC3T3E1增殖和堿性磷酸酶活性的能力。 結(jié)果 亞油酸甲酯與油酸甲酯在0.2～1.2 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，方法學考察結(jié)果符合要求；SFEⅠ的亞油酸和油酸含量分別為318.51～328.64 mg/g和454.25～460.82 mg/g，SFEⅡ的亞油酸和油酸含量分別205.22～211.32 mg/g和228.55～235.13 mg/g。體外研究顯示，SFEⅠ與SFEⅡ組含藥血清可顯著提高成骨細胞MC3T3E1增殖率和堿性磷酸酶活性，且強于醇水提取物組（P < 0.05）。 結(jié)論 補腎活血方超臨界流體萃取物SFEⅠ和SFEⅡ以亞油酸和油酸為主，且誘導成骨細胞分化活性優(yōu)于醇水提取物。

[關(guān)鍵詞] 補腎活血方；超臨界流體萃??；氣相色譜法；成骨細胞增殖；堿性磷酸酶活性

[中圖分類號] R289 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（b）-0008-04

Gas chromatograph quantification and osteoblast cells stimulation study on lipophilic products from Bushen Huoxue Recipe

QIAN Yafang1，2 SHAN Letian3 JIN Hongting3 GU Mancang2

1.Preparation Center， Zhejiang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Province， Hangzhou 310006， China； 2.College of Pharmacy， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Province， Hangzhou 310053， China； 3.Institute of Orthopaedics and Traumatology， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Province， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To establish determination method of lipophilic components in Bushen Huoxue Recipe by gas chromatography（GC）， and investigate the activity of this component to induce osteoblast differentiation. Methods Multiply supercritical fluids were employed to extract lipophilic products SFEⅠ and SFEⅡ from Bushen Huoxue Recipe. Linoleic acid and oleic acid were determined by GC. The proliferation and ALP activity of osteoblast cells were explored after exposure to drug-loaded serums from SFEⅠ and SFEⅡ treated rats. Results Methyl linoleic acid and methyl oleic acid had good linear relationship within the inlet range of 0.2-1.2 μg. Methodological findings met the requirements. Linoleic acid and oleic acid content of SFEⅠ were 318.51-328.64 mg/g and 454.25-460.82 mg/g. Linoleic acid and oleic acid content of SFEⅡ were 205.22-211.32 mg/g and 228.55-235.13 mg/g. The drug-loaded serum from SFEⅠ and SFEⅡ treatment group could significantly stimulate the proliferation and ALP activity in MC3T3E1 cells in vitro compared with that of ethanol-water extraction groups （P < 0.05）. Conclusion The supercritical fluid extracts of Bushen Huoxue Recipe SFEⅠ and SFEⅡ are mainly linoleic acid and oleic acid， and the osteoblast differentiation activity is better than that of alcohol extract.

[Key words] Bushen Huoxue Recipe； Supercritical fluids extraction； Gas chromatograph method； Osteoblast cells proliferation； Alkaline phosphatase activity

臨床與基礎(chǔ)研究表明，脂質(zhì)及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物與骨組織的生長、代謝與重建密切相關(guān)[1-2]。其中油酸、亞油酸等多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）直接參與了骨合成代謝相關(guān)激素的體內(nèi)轉(zhuǎn)化，進而影響骨代謝[3-5]。補腎活血方是浙江省中醫(yī)院治療骨質(zhì)疏松癥的臨床有效方劑[6-7]，藥理研究表明其可提高去卵巢制骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨密度和骨強度[8]。本研究建立了氣相色譜技術(shù)定量檢測補腎活血方超臨界流體萃取所得親脂性組分SFEⅠ和SFEⅡ中主要PUFA含量的方法，并研究SFEⅠ與SFEⅡ?qū)π∈蟪晒羌毎鸐C3T3E1細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響。

1 材料與試劑

HA220-50-01超臨界流體萃取儀（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司），Agilent 6890氣相色譜儀（Agilent公司），SkanIt 4.0多功能酶標儀（Thermo-fisher公司），倒置顯微鏡（Olympus公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）。

SD大鼠，6周齡，清潔級，雌雄各半，體重（200±20）g，購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016。實驗所需中藥飲片購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠。仙靈骨葆膠囊（貴州同濟堂醫(yī)藥有限公司，批號1407019）；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清素（Gibco公司）；PBS緩沖液，胰酶和青/鏈霉（杭州吉諾生物科技有限公司）；堿性磷酸酶檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）油酸甲酯（貨號75160）、亞油酸甲酯（貨號L1876）、十七烷酸甲酯對照品（貨號51633）及二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）（Sigma公司）；正己烷為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 補腎活血方超臨界流體萃取物的制備

參照課題組前期發(fā)表論文方法[9]，取中藥飲片熟地、杜仲、白附片、枸杞、肉桂、山茱萸、桃仁、紅花、山藥、炙甘草，粉碎成最粗粉，按處方比例混合均勻，準確稱取適量，置于超臨界萃取儀萃取釜內(nèi)。萃取條件如下：萃取釜壓力23 MPa、萃取釜溫度38℃、分離器壓力7 MPa、分離器溫度50℃，以CO2超臨界流體萃取4 h，從分離器中得萃取物SFEⅠ。萃取剩余物料在萃取釜壓力25 MPa、萃取釜溫度38℃、分離器壓力6 MPa、分離器溫度45℃的條件下，以含2%乙醇的CO2超臨界流體萃取4 h，從分離器中得萃取物SFEⅡ。

2.2 油酸與亞油酸含量測定方法[10]

2.2.1 氣相色譜條件與系統(tǒng)適應性 色譜柱：HP-INNOWax-PEG色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣N2，流速1.0 mL/min，進樣口溫度210℃，柱溫190℃，保持25 min，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度：210℃，分流比：20∶1，進樣量：1.0 μL，分離度應>1.5，理論板數(shù)以油酸甲酯和亞油酸甲酯峰計應>3000。

2.2.2 對照品供試液制備 分別精密移取油酸甲酯、亞油酸甲酯照品和十七烷酸甲酯對照品（內(nèi)標），正己烷定容至2 mL，即得對照品供試液（分別含油酸甲酯和亞油酸甲酯0.2 mg/mL，內(nèi)標0.1 mg/mL），4℃保存。

2.2.3 樣品供試液制備 精密稱取SFEⅠ與SFEⅡ 30 mg，加0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，充N2，65℃水浴中皂化15 min，加三氟化硼甲醇溶液2 mL，65℃甲酯化2 min，精密加正己烷4 mL，振搖，加飽和氯化鈉溶液至刻度，充N2，靜置待分層，精密吸取上層液1.0 mL，加內(nèi)標貯備液0.5 mL，正己烷定容，即得，4℃保存。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液、過0.45 μm濾膜，供試品溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，測定，以內(nèi)標法計算，即得。

2.3 方法學考察[11]

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密移取對照品供試液適量，正己烷定容，制備油酸甲酯與亞油酸甲酯濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的一系列對照品工作液，取0.2 μL后注入氣相色譜儀，記錄峰面積。以對照品的濃度（mg/mL）為橫坐標，對照品和內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標，考察線性關(guān)系。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，每隔2 h測定1次，計算對照品峰面積與內(nèi)標峰面積比值，計算RSD值。

2.3.3 重復性試驗 取同一供試品溶液進行3次平行測定，計算油酸甲酯與亞油酸甲酯平均含量以及RSD值。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品供試品適量，精密加入對照品儲備液適量，使油酸甲酯與亞油酸甲酯量為供試品中相應物質(zhì)量的80%、100%與120%，注入氣相色譜，測定油酸甲酯與亞油酸甲酯含量，計算回收率。

2.4 細胞培養(yǎng)

小鼠成骨細胞MC3T3E1常規(guī)貼壁生長，傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的α-MEM完全培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育，2 d換液，3 d傳代1次。

2.5 含藥血清制備

含藥血清制備方法所有動物按體重隨機分為11組，每組3只：空白血清對照組，仙靈骨葆膠囊陽性對照組，補腎活血方SFEⅠ和SFEⅡ以及醇水提物低、中、高劑量組（分別相當于12.5、25、50 g生藥/kg體重），連續(xù)灌胃3 d，參考課題組前期發(fā)表論文方法制備含藥血清[12]。

2.6 成骨細胞增殖實驗（MTT）法

取對數(shù)生長期成骨細胞MC3T3E1，按3×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，孵育過夜。將各組含藥與空白對照組血清加入各細胞培養(yǎng)孔，使血清終濃度為2%，設(shè)立不含細胞的對照孔。放回培養(yǎng)箱孵育48 h，按MTT法要求操作，490 nm下測定吸光度（OD），計算成骨細胞凈增殖率。成骨細胞凈增殖率=[（含藥血清處理孔OD-溶劑對照孔OD）-（空白血清處理孔OD-溶劑對照孔OD）]/（空白血清處理孔OD-溶劑對照孔OD）×100%。

2.7 堿性磷酸酶活性實驗（pNPP）法

按“2.6”項下方法操作，吸取各孔培養(yǎng)液，小心用PBS洗滌一次，按堿性磷酸酶檢測試劑盒要求操作，同時制作標準曲線，在405 nm測定各孔OD，計算各孔堿性磷酸酶活性。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 氣相色譜圖及線性關(guān)系

氣相色譜圖見圖1，結(jié)果顯示十七烷酸甲酯、亞油酸甲酯和油酸甲酯色譜峰分離度良好，樣品檢測無干擾。亞油酸回歸方程為y=0.6774x-0.2596（R=0.9993），油酸回歸方程為y=1.4151x-0.5080（R=0.9991），亞油酸甲酯與油酸甲酯進樣量在0.2～1.2 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

3.2 方法學考察結(jié)果

重復性考察結(jié)果萃取物中亞油酸甲酯與油酸甲酯平均含量分別為221.6 mg/g（RSD=1.88%）和246.4 mg/g（RSD=1.51%）；穩(wěn)定性考察結(jié)果亞油酸和油酸24 h內(nèi)峰面積比變化值的RSD分別為1.14%和2.26%；加樣回收結(jié)果萃取物中亞油酸與油酸的平均加樣回收率分別為98.89%（RSD=2.33%）和97.79%（RSD=2.39%）；方法學考察各項指標均符合要求。

3.3 萃取物中亞油酸、油酸含量測定結(jié)果

分別取三批萃取物SFEⅠ和SFEⅡ的樣品，測定其中亞油酸甲酯與油酸甲酯含量，根據(jù)相對分子質(zhì)量換算得到樣品中亞油酸和油酸的含量，由表1可知亞油酸與油酸質(zhì)量之和約占SFEⅠ和SFEⅡ總質(zhì)量的78.8%與44.5%。

3.4 萃取物誘導細胞增殖活性結(jié)果

補腎活血方萃取物SFEⅠ中、高劑量組，SFEⅡ各劑量組和醇水提取物高劑量組含藥血清誘導細胞增殖率顯著高于空白血清對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。SFEⅠ中劑量組、SFEⅡ低劑量組含藥血清誘導細胞增殖率顯著高于補腎活血方醇水提取物相應劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

3.5 萃取物誘導細胞堿性磷酸酶活性結(jié)果

補腎活血方萃取物SFEⅠ、SFEⅡ和醇水提取物各劑量組含藥血清誘導細胞堿性磷酸酶活性均顯著強于空白血清對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。SFEⅠ中、高劑量組及SFEⅡ低、中、高劑量組含藥血清誘導胞漿堿性磷酸酶活性作用顯著強于醇水提取物相應劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

4 討論

補腎活血方以右歸飲加桃仁、紅花組成，臨床用于治療因腎陽不足、血瘀內(nèi)停所致的骨質(zhì)疏松癥患者。本課題組前期采用醇水雙提法精制得到補腎活血顆粒，經(jīng)動物實驗證明其可激活成骨細胞Wnt/β-catenin信號通路[13]，并抑制破骨細胞整合素αVβ3表達[14]，提高骨密度和骨強度[15]。然而該方中不乏桃仁、肉桂等富含親脂性和揮發(fā)性組分的藥味，傳統(tǒng)的醇水雙提法僅能富集復方中水溶性和極性組分[16]。流行病學研究已經(jīng)證明，PUFA攝入量與人體的骨密度呈正相關(guān)[17-18]；動物實驗表明PUFA可提高去卵巢大鼠的骨量和骨密度[19-20]。為研究補腎活血方中的親脂性組分的化學組成及其誘導成骨細胞分化的能力，本研究建立了氣相色譜分析補腎活血方多元超臨界流體萃取物SFEⅠ和SFEⅡ中主要PUFA組成——油酸與亞油酸含量的方法，含量測定表明油酸與亞油酸為SFEⅠ和SFEⅡ中的主要成分。血清藥理學研究顯示，SFEⅠ和SFEⅡ組含藥血清可顯著誘導成骨細胞前體MC3T3E1增殖，并顯著增強細胞堿性磷酸酶活性，且作用強于醇水提取物組。本研究結(jié)果表明，補腎活血方經(jīng)超臨界流體萃取所得的親脂性組分也可能具有治療骨質(zhì)疏松癥的潛力，但需進一步的藥效學實驗證明。

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（收稿日期：2016-11-28 本文編輯：李亞聰）