康雪微，胡秀彩，孫金輝，孫敬鋒，呂愛軍，通信作者，宋亞嬌，YEONG Yiksung，石洪玥，郭立

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

金魚腐皮病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

康雪微1，胡秀彩1，孫金輝1，孫敬鋒1，呂愛軍1，通信作者，宋亞嬌2，YEONG Yiksung1，石洪玥1，郭立1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

從患腐皮病金魚肝臟中分離獲得1株細(xì)菌，編號為KL-1，通過細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化特性、16S rDNA克隆測序及構(gòu)建發(fā)育樹分析等系統(tǒng)鑒定，并進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)、藥敏特性研究。結(jié)果表明，KL-1菌株為革蘭氏陰性短桿菌，可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，氧化酶、接觸酶、賴氨酸脫羧酶等為陽性；進(jìn)一步采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列，將其亞克隆至pMD18-T載體中，測序獲得長度為1 507 bp，與Aeromonas veronii模式菌株ATCC 35624（X74684）序列相似性為99.66%，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析與其聚為一支，鑒定KL-1菌株為維氏氣單胞菌（Aeromones veronii）。動(dòng)物感染試驗(yàn)表明，對斑馬魚半數(shù)致死量LD50為1.4×107cfu/mL。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該病原菌對頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢氨芐、萘啶酸、恩諾沙星、左氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考和氯霉素等藥物敏感。

金魚；維氏氣單胞菌；致病性；藥敏試驗(yàn)

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）屬于氣單胞菌科（Aeromonuduceue）氣單胞屬（Aeromonas），普遍存在于水環(huán)境以及土壤中[1]。維氏氣單胞菌可感染引起魚類大量死亡，人類食用維氏氣單胞菌污染的蔬菜、水產(chǎn)品等食物會(huì)導(dǎo)致腹瀉、敗血癥以及食物中毒等病癥[2]。近幾年，該菌感染水產(chǎn)動(dòng)物增多，流行范圍逐步擴(kuò)大，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已有報(bào)道維氏氣單胞菌感染鰍（Misgurnus anguillicaudatus）、蟹（Eriocheir sinensis）、鯉（Cyprinus carpio）、羅非魚（Oreochromis spp.）等多種水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病[3-5]。關(guān)于觀賞魚感染維氏氣單胞菌的分離鑒定，目前研究報(bào)道較少[6-7]。2016年3—5月，天津市某觀賞魚養(yǎng)殖基地金魚暴發(fā)傳染性腐皮病，病魚主要出現(xiàn)皮膚潰爛、表皮發(fā)白，鱗片脫落、鰭基出血等癥狀，感染后期發(fā)生死亡現(xiàn)象。本研究從發(fā)病金魚肝臟中分離得到1株細(xì)菌，對其進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA克隆測序、生理生化特征等鑒定研究，以期為觀賞魚類細(xì)菌性疾病防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患腐皮病金魚來自天津市某觀賞魚養(yǎng)殖基地。健康藍(lán)斑馬、紅斑馬魚購自天津某花鳥魚市場，室溫飼養(yǎng)觀察1周，確保健康無病后用于感染試驗(yàn)。LB培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管和藥敏紙片等均購自杭州微生物科技有限公司，Bio-TekeDNA膠回收試劑盒、pMD18-T載體、PCR Master Mix等均購自新鄉(xiāng)智寶科儀儀器有限公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化

無菌操作取患病金魚肝臟組織，涂布接種于LB平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h。挑取典型單個(gè)菌落進(jìn)行2～3次分離純化，得到純菌種，30%甘油與菌液以 1:1比例混合，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)

無菌操作挑取適量菌落接種于細(xì)菌生化微量鑒定管，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果，參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》[8]對其進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化鑒定。

1.2.3 細(xì)菌DNA提取，16S rDNA基因克隆及序列分析

細(xì)菌總DNA提取采用煮沸法[9]，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?6S rDNA基因 PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌通用引物 27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，反應(yīng)體系（20 μL）：Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，DNA 模板1 μL，上下游引物各 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性5 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用Bio-Teke膠回收試劑盒回收純化16S rDNA目的片段，與 pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，采用引物M13-47：5’-CGCCAGGGTTTT CCCAGTC ACGAC-3’，RV-M：5’-GAGCGGATAA CAATTT CACACAGG-3’檢測篩選陽性克隆，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，參照馮思玲[10]的方法，將16S rDNA序列通過NCBI的Blast檢索序列同源性分析，采用 MEGA5.05軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 動(dòng)物感染試驗(yàn)

參照張培等[11]方法進(jìn)行，將分離菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)18 h，用麥?zhǔn)媳葷醿x測量菌液濃度，用無菌生理鹽水稀釋至 2.68×108cfu/mL。選取健康斑馬魚為試驗(yàn)對象，采用腹腔注射法，接種量為10 μL/尾，分5組濃度梯度（分別為 2.68×108、2.68×107、2.68×106、2.68×105、2.68×104cfu/mL），每組10尾魚進(jìn)行注射。對照組注射等量無菌生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，記錄死亡情況，Bliss法計(jì)算半數(shù)致死量LD50。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片擴(kuò)散法對分離菌株進(jìn)行常用抗生素藥物的敏感性檢測，涂布法接種分離菌株于LB平板上，按分類貼好藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)36 h后測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次計(jì)算平均值，按說明書判斷分離菌株對藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的形態(tài)特征

從患腐皮病金魚肝臟中分離純化獲得1株細(xì)菌，編號為KL-1，該菌在LB培養(yǎng)基上生長良好，呈圓形、透明、表面濕潤、邊緣整齊的小菌落；革蘭氏染色顯示陰性短桿菌（圖1）。

圖1 KL-1菌株革蘭氏染色（標(biāo)尺5 μm）

2.2 生理生化特征

KL-1菌株能利用葡萄糖產(chǎn)氣，氧化酶、接觸酶、苯丙氨酸酶、賴氨酸脫羧酶等試驗(yàn)為陽性，鳥氨酸、硫化氫、葡萄糖酸鹽、尿素、木糖、側(cè)金盞花醇等為陰性（表1），符合《常見細(xì)菌鑒定手冊》等[8]描述氣單胞菌屬（Aeromonas）細(xì)菌特征。

表1 KL-1菌株生理生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 16S rDNA序列、系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用PCR方法擴(kuò)增KL-1菌株的16S rDNA基因序列，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)出 1條大小約1 500 bp目的條帶（圖2，泳道1，2）；將其亞克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克?。▓D2，泳道3～10），測得16S rDNA長度為1 507 bp。Blast比對與A.veronii模式菌株ATCC 35624（X74684.1）序列同源性為99.66%。從NCBI數(shù)據(jù)庫選取10個(gè)氣單胞菌屬模式菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示KL-1菌株與A.veronii模式菌株 ATCC35624（X74684.1）序列親緣關(guān)系最近，自然聚類為一支（圖 3），最終確定 KL-1菌株為維氏氣單胞菌（A.veronii）。

圖2 KL-1菌株16S rDNA序列PCR擴(kuò)增電泳及陽性克隆檢測

圖3 KL-1菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.4 動(dòng)物感染與藥敏試驗(yàn)結(jié)果

KL-1菌株人工腹腔注射斑馬魚，測定半數(shù)致死量（LD50）為1.4×107cfu/mL，其中以2.68×108cfu/mL菌液濃度感染斑馬魚 12 h后死亡率達(dá)80%，24 h后死亡率達(dá)100%，死亡斑馬魚主要出現(xiàn)體表出血，腹部膨脹、腐皮等臨床癥狀（圖4a，b），這與自然感染金魚發(fā)病癥狀基本一致?；疾〗痿~主要表現(xiàn)為皮膚潰爛、表皮發(fā)白、鱗片脫落、鰭基部出血等腐皮病癥狀，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟色淡、有腹水（圖4c，d），從感染死亡斑馬魚肝臟中再次分離獲得1株細(xì)菌，與KL-1菌株特征完全一致。感染魚死亡率見表2，對照組無發(fā)病死亡現(xiàn)象。

圖4 KL-1菌株人工感染斑馬魚、金魚臨床癥狀

表2 斑馬魚感染死亡情況

采用30種抗生素對KL-1菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株對頭孢菌素類（頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢氨芐）、喹諾酮類（萘啶酸、恩諾沙星、左氟沙星、諾氟沙星）、氨基糖苷類（慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素）、氯霉素類（氯霉素、氟苯尼考）等20種藥物敏感，對阿莫西林、氨芐西林、美羅培南、萬古霉素、四環(huán)素、克林霉素、利福平等10種抗生素耐藥（表3）。

表3 KL-1菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

維氏氣單胞菌廣泛分布于水、土壤環(huán)境中，該菌成為一種重要的“人—獸—魚”共患條件致病菌[2-3]。最近，Sun等[12]從患病的異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）中分離獲得2株優(yōu)勢菌，通過對胞外酶、毒力基因PCR檢測以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等鑒定為致病性維氏氣單胞菌。李聰?shù)萚4]從養(yǎng)殖場患病羅非魚體內(nèi)分離出優(yōu)勢菌，確定此次羅非魚暴發(fā)型疾病的病原菌為維氏氣單胞菌。高金偉等[13]從患病鱖肝臟中分離到維氏氣單胞菌，通過人工感染回歸試驗(yàn)確定為致病性維氏氣單胞菌。汪開毓等[14]研究表明，斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus punetaus）維氏氣單胞菌有較強(qiáng)致病性。賀揚(yáng)等[1]報(bào)道致病性維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物在入侵感染以及斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)病死亡過程中起重要作用。馬志宏等[15]認(rèn)為，維氏氣單胞菌是引起養(yǎng)殖西伯利亞鱘（Acipenser baeri）魚病害的主要致病菌之一。楊小強(qiáng)[6]從患病金魚（Carassius auratus）脾臟中分離到維氏氣單胞菌，人工感染試驗(yàn)動(dòng)物陸續(xù)死亡，病變癥狀與養(yǎng)殖場自然發(fā)病金魚相似。Sreedharan等[7]從患病淡水觀賞魚腹腔液以及內(nèi)臟器官中分離獲得維氏氣單胞菌，感染病魚臨床癥狀主要表現(xiàn)為水腫、出血敗血癥以及尾鰭腐爛。本研究從患腐皮病金魚肝臟中分離得到1株致病性維氏氣單胞菌，主要引起金魚皮膚潰爛、鱗片脫落、鰭基出血等臨床癥狀。針對金魚腐皮菌的發(fā)病機(jī)制，目前尚未見報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。

近年來，水產(chǎn)動(dòng)物在養(yǎng)殖過程中大量使用抗生素等，造成病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)，大大增加了魚類疾病臨床治療的難度。Sun等[12]報(bào)道維氏氣單胞菌對頭孢菌素類、氨基糖甙類等抗生素敏感。Gashgari等[16]自患病金頭鯛（Sparus aurata）中分離獲得的維氏氣單胞菌對羧芐青霉素、先鋒霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萘啶酸等敏感，尤其對環(huán)丙沙星高度敏感。秦國民等[17]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，錦鯉（Cyprinus carpio）維氏氣單胞菌對諾氟沙星、哌拉西林、頭孢哌酮、四環(huán)素等敏感，對氨芐西林、阿莫西林等耐藥。金魚（C. auratus）維氏氣單胞菌對氯霉素、氟苯尼考、頭孢氨芐、利福平和新生霉素等敏感[6]。本研究采用 30種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，KL-1菌株對頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢氨芐、萘啶酸、恩諾沙星、左氟沙星、諾氟沙星、氯霉素、氟苯尼考等多種藥物敏感。目前，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）漁業(yè)委員會(huì)禁止氯霉素、克林霉素、四環(huán)素等藥物用于魚病防治[18]，這在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)該引起重視。以上報(bào)道魚類維氏氣單胞菌對頭孢類、喹諾酮類、氨基糖甙類、氯霉素類等敏感特性與本研究結(jié)果基本一致，這為觀賞魚類感染維氏氣單胞菌臨床防治提供了科學(xué)參考。

[1] 賀揚(yáng)，華麗，汪開毓，等. 高致病性維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物對斑點(diǎn)鲖的致病性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2016，40（3）：458-465.

[2] 吳同壘，單曉楓，孟慶峰，等. 維氏氣單胞菌研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2011，45（7）：41-44.

[3] Bomar L，Stephens W Z，Nelson M C，et al. Draft genome sequence of Aeromonas veronii Hm21，a symbiotic isolate from the medicinal leech digestive tract[J]. Genome Announc，2013，1（5）：e00800-13.

[4] 李聰. 羅非魚源維氏氣單胞菌的分離鑒定及基因分型研究[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2015.

[5] Sreedharan K，Philip R，Singh I S. Isolation and characterization of virulent Aeromonas veronii from ascitic fluid of oscar Astronotus ocellatus showing signs of infectious dropsy[J]. Dis Aquat Organ，2011，94（1）：29-39.

[6] 楊小強(qiáng). 金魚維氏氣單胞菌的分離鑒定與藥敏分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（6）：256-258.

[7] Sreedharan K，Philip R，Singh I S. Characterization and virulence potential of phenotypically diverse Aeromonas veronii isolates recovered from moribund freshwater ornamental fishes of Kerala，India[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2013，103（1）：53-67.

[8] 蔡妙英，東秀珠. 常見細(xì)菌鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[9] 陳光麗，劉海林，馬健. 煮沸法提取細(xì)菌DNA在布病病原檢測中的應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2015，1：28-29.

[10] 馮思玲. 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法研究[J]. 信息技術(shù)，2009，3（6）：38-41.

[11] 張培，朱愛華，胡秀彩，等. 金魚類志賀鄰單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2015，34（6）：375-379.

[12] Sun J，Zhang X，Gao X，et al. Characterization of virulence properties of Aeromonas veronii isolated from diseased gibel carp（Carassius gibelio）[J]. Int J Mol Sci，2016，17（4）：496.

[13] 高金偉，梁利國，王亞冰，等. 鱖源致病性維氏氣單胞菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2004，26（32）：256-273.

[14] 汪開毓，肖丹，范方玲，等. 魚源維氏氣單胞菌的生物特性和基因分型[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（4）：367-374.

[15] 馬志宏，楊慧，羅琳，等. 西伯利亞鱘致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2009，49（10）：1290-1293.

[16] Gashgari R M，Selim S A. Detection and characterization of antimicrobial resistance and putative virulence genes in Aeromonas veronii biovar sobria isolated from gilthead sea bream（Sparus aurata L.）[J]. Foodborne Pathog Dis，2015，12（9）：806-811.

[17] 秦國民，張曉君，陳翠珍，等. 錦鯉維氏氣單胞菌感染癥及其病原生物學(xué)特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（19）：8115-8117.

[18] 張文革. 無公害養(yǎng)殖中的常用漁藥及各類禁藥簡介[J].北京水產(chǎn)，2008，112（3）：65-66.

責(zé)任編輯：張愛婷

Isolation, Identification and Antibiotics Susceptibility of the Pathogenic Bacteria Isolated from the Putrid Skin Diseased Carassius Auratus

KANG Xue-wei1, HU Xiu-cai1, SUN Jin-hui1, SUN Jing-feng1, Lü Ai-jun1,CorrespondingAuthor, SONG Ya-jiao2,YEONG Yiksung1, SHI Hong-yue1, GUO Li1
（1. Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384,China; 2. College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan Province, China）

A bacterial strain was isolated from the liver of the Putrid Skin Diseased Carassius auratus, named KL-1. The morphological observation, physiological and biochemical characteristics, the cloning and sequencing of 16S rDNA and phylogenetic tree analysis, animal infection test and the antibiotic susceptibility analysis were carried out in this study. Results showed that KL-1 strain was a rod-shaped, gram-negative bacillus, it can produce acid and gas fromglucose, oxidase, catalase and lysine decarboxylase showed positive reaction; Furthermore, the 16S rDNA sequences was amplified by PCR method, and subcloned into pMD18-T vector, a product of sequencing was 1 507 bp in length. It had a 99.66% similarity of 16S rDNA sequence with Aeromonas veronii type strain ATCC 35624（X74684）, and clustered into one group with A. veronii, so the KL-1 strain was identified as A. veronii. Artificial infection test showed that the median lethal（LD50）to zebrafish was 1.4×107cfu/mL.The susceptibility testing with different antibiotics showed that it was sensitive to cefixime, cefoperazone, cefotaxime, cephalexin,clindamycin, nalidixic acid, enrofloxacin, difloxacin, norfloxacin, and florfenicol, chloramphenicol etc.

goldfish; Aeromonas veronii; pathogenicity; drug sensitivity test

S943

：A

2016-09-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“彈狀病毒誘導(dǎo)斑馬魚皮膚和鰓免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)組研究”（31272692）；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目“黏蛋白在半滑舌鰨皮膚免疫應(yīng)答過程中的功能研究”（16JCZDJC33500）及“半滑舌鰨腸道微生態(tài)與免疫力關(guān)系研究”（15JCZDJC34000）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“蝦、貝類疾病防治”（ITTFRS2017009）

康雪微（1994-），女，黑龍江海倫人，本科在讀，主要從事水族科學(xué)與技術(shù)方面研究。E-mail：2425173584@qq.com。

呂愛軍（1973-），男，內(nèi)蒙古太仆寺旗人，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物與免疫學(xué)方面研究。E-mail：lajand@126.com。

1008-5394（2017）02-0053-05