吳海清，甄潤(rùn)英,通信作者，何新益，孫貴寶

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

蘿卜葉黃酮的超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

吳海清1,2，甄潤(rùn)英1,2,通信作者，何新益1,2，孫貴寶1,2

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

用超聲波輔助乙醇提取蘿卜葉中的黃酮。通過(guò)單因素試驗(yàn)與四元三次正交試驗(yàn)，對(duì)黃酮的超聲波輔助醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化，以體外清除（·OH）和（O2-·）的能力為指標(biāo)，研究蘿卜葉黃酮的抗氧化活性。最優(yōu)條件：乙醇濃度為60%，料液比為1:15（m∶V），超聲波處理15 min，在50 ℃下浸提30 min，該條件下黃酮提取率為1.41%，是傳統(tǒng)浸提法的200%；蘿卜葉黃酮對(duì)·OH和O2-·均有明顯的清除作用，在試驗(yàn)劑量下，清除效果隨著黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，對(duì)·OH和 O2-·的半數(shù)抑制率（IC50）分別為0.643 8、1.523 1 mg/mL。結(jié)果表明：超聲波輔助提取是一種高效的提取蘿卜葉黃酮方法，其抗氧化活性較高。

蘿卜葉；黃酮；超聲波；輔助；抗氧化

蘿卜葉為十字花科植物蘿卜的根出葉，又名蘿卜桿、萊菔葉和萊菔菜等?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，蘿卜葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在很多方面均高于蘿卜，如Vc含量是蘿卜的2倍以上，鈣、鎂、鐵、鋅以及核黃素、葉酸等含量是蘿卜的3～10倍[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)的一些學(xué)者相繼開(kāi)展了蘿卜葉的綜合利用研究。吳海清等[2]將蘿卜葉制成醬菜，并比較測(cè)定了不同加工階段蘿卜葉醬菜中營(yíng)養(yǎng)素的變化及微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化；董周永等[3]以蘿卜葉為原料，采用超聲波輔助法提取葉綠素，其葉綠素平均得率為0.413%；Da-Hee Chung等[4-5]研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜葉中乙酸乙酯提取物具有抗氧化和抗癌功能，對(duì)自發(fā)性高血壓小鼠的血壓有調(diào)節(jié)作用[6]。但目前蘿卜葉的總體利用率還很低，既造成了資源浪費(fèi)又污染了環(huán)境。

傳統(tǒng)的黃酮提取方法主要有浸提、回流提取法等，新興的方法主要有微波輔助提取法、超聲波輔助提取法與超臨界萃取法等[7]，已有相關(guān)學(xué)者采用超聲波輔助提取法分別從紫蘇、辣椒、沙棘等植物葉子中提取總黃酮[8-10]，提取率分別為5.410%、4.730%、5.034%。本研究擬采用超聲波輔助乙醇浸提法對(duì)蘿卜葉中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并對(duì)蘿卜葉總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究，為蘿卜葉黃酮高效提取及其抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論知識(shí)，為今后植物源產(chǎn)品的高值化開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蘿卜葉：于2015年11月中旬采自天津市武清區(qū)田水鋪村，蘿卜葉清洗后烘干，超微粉碎過(guò)80目篩，冷藏保存。

主要試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純，由天大科威試劑公司提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘿卜葉黃酮的提取工藝流程

蘿卜葉→干燥、粉碎→超聲波處理→浸提→離心→過(guò)濾→黃酮提取液

操作要點(diǎn)：

（1）原料預(yù)處理：新鮮蘿卜葉清洗、瀝水后切成2 cm左右的小段，于65 ℃烘箱中烘干、粉碎過(guò)篩（80目），密封存儲(chǔ)備用。

（2）提?。悍Q取2 g蘿卜葉粉于三角瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入一定量的乙醇溶液，用封口膜封好后置于超聲波清洗儀中進(jìn)行超聲處理，超聲波功率為1 130 W，頻率為50 Hz，然后置于恒溫水浴上浸提一定時(shí)間，于4 000 r/min 下離心10 min，得到蘿卜葉黃酮提取液，進(jìn)行總黃酮測(cè)定。

1.2.2 蘿卜葉黃酮提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以總黃酮提取率為指標(biāo)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波處理時(shí)間、料液比（m︰V）、浸提溫度、浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響。

1.2.2.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

料液比為1:10，超聲波處理20 min，60 ℃浸提1 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%，觀察乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.2.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

料液比為1:10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲波處理時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min，然后于60 ℃下浸提1 h，測(cè)定黃酮提取率，觀察超聲波處理時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.2.3 料液比（m∶V）對(duì)黃酮提取率的影響

料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲波處理均為20 min，60 ℃下浸提1 h，研究料液比對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.2.4 浸提溫度對(duì)黃酮提取率的影響

料液比為1:10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲波處理20 min，浸提時(shí)間1 h，浸提溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，考察浸提溫度對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.2.5 浸提時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

料液比為1:10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲波處理20 min，在60 ℃浸提溫度下分別浸提5、15、20、30、45、60、75、90 min，考察浸提時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.3 提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)超聲波處理后，浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響不大，因此，選擇乙醇濃度、超聲波處理時(shí)間、料液比、浸提溫度4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交因素與水平表

1.2.4 黃酮類(lèi)化合物的測(cè)定方法

采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法[14]。按公式（1）計(jì)算總黃酮提取率。

提取率（%）＝測(cè)量濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積/材料粉末質(zhì)量×100 （1）

1.2.5 蘿卜葉黃酮抗氧化活性的測(cè)定

測(cè)定提取物對(duì)羥自由基及超氧陰離子的清除作用。對(duì)·OH清除作用參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行測(cè)定，對(duì)O2清除作用參照文獻(xiàn)[12]測(cè)定。按公式（2）計(jì)算清除率。

式中：SA—清除率；A0—不加樣品的吸光度；A1—加入樣品的吸光度；A2—本底的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

從圖1可知，黃酮提取率先隨乙醇濃度的增加而增加，當(dāng)乙醇濃度為 60%時(shí)達(dá)到最高值，隨后呈下降趨勢(shì)。隨著乙醇濃度的逐漸升高，醇溶性物質(zhì)的溶出率也隨之增加，所以黃酮提取率先呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；乙醇濃度過(guò)高，一些醇溶性和脂溶性的雜質(zhì)溶出量也逐漸增多，這些成分可能會(huì)與乙醇-水分子體系結(jié)合，與黃酮類(lèi)化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，影響黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致黃酮提取率下降[13]。所以選用濃度為50%、60%、70%的乙醇做正交試驗(yàn)。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.1.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)提取率的影響

從圖2可知，隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率不斷增大，20 min時(shí)達(dá)到最大值，隨后總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)。延長(zhǎng)浸提時(shí)間，有利于黃酮充分溶出；超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，醇溶性雜質(zhì)的溶出量也會(huì)增加，對(duì)黃酮形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使總黃酮提取率下降[13]。綜合考慮能源、提取效率及提取率等問(wèn)題，進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，超聲波處理時(shí)間選擇10、15、20 min。

圖2 超聲波處理時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)提取率的影響

如圖3所示，黃酮提取率先隨料液比的增大而增大，當(dāng)料液比為1:15時(shí)達(dá)到最大值，隨后隨著料液比的增加，總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)。提高料液比，有利于類(lèi)黃酮充分的溶出及擴(kuò)散；繼續(xù)增加料液比，可能使一些極性較大的黃酮無(wú)法溶出[14]，也可能引起其他醇溶性物質(zhì)的溶出[15]，因而黃酮提取率下降。綜合考慮選擇料液比 1:5、1:10、1:15進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

2.1.4 溫度對(duì)提取率的影響

如圖4所示，在提取溫度低于60 ℃時(shí)，隨著提取溫度的上升，黃酮提取率也隨之增加，高于60 ℃后，黃酮提取率下降。這可能是由于隨著溫度的升高，黃酮在乙醇溶液中的溶解度增加；同時(shí)由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，擴(kuò)散速率增加，促使提取速度加快[16]。但是當(dāng)溫度過(guò)高，黃酮類(lèi)物質(zhì)容易被氧化，分子結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞。故本試驗(yàn)選擇提取溫度50、60、70 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 提取溫度對(duì)提取率的影響

2.1.5 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

如圖5所示，初始階段黃酮提取率呈上升趨勢(shì)，浸提時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，出現(xiàn)峰值，隨后呈下降趨勢(shì)，但提取率總體變化不大，故不將提取時(shí)間作為正交試驗(yàn)的因素，提取時(shí)間固定為30 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證試驗(yàn)

正交試驗(yàn) L9（34）試驗(yàn)因素、水平及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2極差分析得出，影響黃酮提取率的因素順序?yàn)椋阂掖紳舛龋玖弦罕龋境暡〞r(shí)間＞浸提溫度，最優(yōu)提取工藝條件為 A2C3B2D1，即：乙醇濃度為60%，料液比為1:15，超聲波處理15 min，在50 ℃條件下水浴浸提30 min。

以最優(yōu)組合進(jìn)行 5次重復(fù)性試驗(yàn)，黃酮的平均提取率為 1.41%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD值為1.06%，表明其重復(fù)性良好。

以本試驗(yàn)得到的最佳乙醇濃度（60%），料液比為（1:15），在50 ℃條件下，采用直接浸提法，提取時(shí)間（30 min），黃酮的提取率僅為0.67%。由此可見(jiàn)，超聲波輔助處理可以顯著提高黃酮的提取率。

2.3 黃酮提取物的抗氧化活性研究結(jié)果

采用正交試驗(yàn)的最優(yōu)工藝條件提取蘿卜葉黃酮，黃酮提取物對(duì)·OH和 O2-·的清除作用見(jiàn)表 3。由表3可以看出，蘿卜葉黃酮對(duì)·OH和 O2-·均具有清除作用，且隨黃酮濃度的增大清除率增加，在濃度3.0 mg/mL時(shí)清除率達(dá)100%，即在0.1～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，清除率與黃酮的濃度存在著劑量效應(yīng)關(guān)系。在同一濃度下，對(duì)·OH的清除率明顯大于對(duì) O2-·的清除率。這可能與黃酮類(lèi)化合物的具體結(jié)構(gòu)以及清除不同自由基的具體作用機(jī)理不同有關(guān)[15]。

表3 蘿卜葉黃酮對(duì)·OH和 O2-·的清除作用

3 結(jié)論

以乙醇為提取劑，通過(guò)超聲波輔助提取方法，篩選出蘿卜葉黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度為60%，料液比為1:15，超聲波處理15 min，在50 ℃條件下水浴浸提30 min。在此工藝下，蘿卜葉黃酮提取率為 1.41%，明顯高于直接浸提法（提取率為 0.67%）。蘿卜葉黃酮對(duì)羥自由基·OH和 O2-·具有明顯的清除作用，在一定劑量范圍內(nèi)，清除效果隨著黃酮濃度的增加而增強(qiáng)。由于試驗(yàn)條件等因素的約束，對(duì)黃酮的構(gòu)象未能給出結(jié)論，有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology and Antioxidant Activities of Flavonoids in Radish Leaves

WU Hai-qing1,2, ZHEN Run-ying1,2,CorrespondingAuthor, HE Xin-yi1,2, SUN Gui-bao1,2
（1. College of Food Science and Biotechnology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300384, China）

Total flavonoids were extracted from radish leaves using ethanol as extraction solvent with the aid of ultrasonic treatment. Five single-factor experiments with four factors triple orthogonal design was adopted to research the ultrasonic-assisted ethanol extraction process of flavonoids in the water bath. The scavenging abilities against hydroxyl radicals（·OH） and （O2-·） in vitro of flavonoids were determined. The results indicated that the optimum extraction parameters were as follows：the volum fraction of ethanol was 60%, solid-liquid ratio was 15（m:V）, ultrasonic treatment 15min, immerse 30 min under the temperature of 50 ℃ . Under these conditions, the extraction rate of total flavonoids is up to 1.41%, was the traditional extraction method of 200%. Flavonoids of radish leaves can effectively scavenge·OH and O2-·, and the role of these effect increased with the increase of flavonoids concentration, IC50were 0.643 8, 1.523 1 mg/mL. These results demonstrated that UAE was a highly effective way to extract flavonoids from radish leaves and the antioxidant activity of flavonoids was high.

radish leaves; flavonoids; ultrasonic wave; assisted; antioxidant

TS201.1

：A

2016-07-10

天津市農(nóng)業(yè)科技合作項(xiàng)目“特色品牌青蘿卜產(chǎn)業(yè)化配套新技術(shù)集成示范”（201410061027）

吳海清（1982－），女，天津市人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事食品科學(xué)及生物工程方面的研究。E-mail：haiqing_w@yeah.net。

甄潤(rùn)英（1962－），女，天津市人，教授，碩士，主要從事食品加工及營(yíng)養(yǎng)檢測(cè)方面的研究。E-mail：zhenrunying@tjau.edu.cn。

1008-5394（2017）02-0063-04