顏寶紅，常 育

新型微管穩(wěn)定劑吲哚美辛衍生物的合成與抗腫瘤活性研究

顏寶紅，常 育

目的 設(shè)計(jì)合成一系列吲哚美辛衍生物并測(cè)定其體外抗腫瘤和微管蛋白抑制活性。方法 以5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸為起始原料經(jīng)兩步?；磻?yīng)合成12個(gè)化合物，MTT法檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)HT29、A549、Hep-2、MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制活性，同時(shí)采用濁度法評(píng)價(jià)其體外微管蛋白的抑制作用。結(jié)果 12種目標(biāo)化合物均呈現(xiàn)了優(yōu)于吲哚美辛的體外抗腫瘤作用和微管蛋白抑制活性，其中3位羧基側(cè)鏈苯乙基取代的化合物12作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的IC50(2.2 μmol)為吲哚美辛的400倍，并且可以干擾微管聚合，其作用于微管蛋白的IC50為5.6 μmol。結(jié)論 改變吲哚美辛1位酰胺和3位羧酸側(cè)鏈所得的系列衍生物是一類新型的以微管為靶點(diǎn)的抗腫瘤候選藥物。

微管;吲哚美辛;合成;抗腫瘤

0 引言

微管是構(gòu)成細(xì)胞完整功能的一部分，參與細(xì)胞有絲分裂中的染色體分離、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞形態(tài)的形成與維持、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞膜上分子的分布等[1]。因此，破壞微管的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性將直接影響腫瘤細(xì)胞的快速增殖。近年來(lái)，環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑非甾體抗炎藥(NSAIDs)常被應(yīng)用于臨床腫瘤疾病的治療[2]，尤其對(duì)COX-2高表達(dá)的結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展具有較強(qiáng)的抑制作用[3-4]。另外，曾有學(xué)者通過(guò)模擬紫杉醇和秋水仙堿與微管蛋白的作用方式，采用蛋白質(zhì)組學(xué)和生物化學(xué)的方法探究了COX-2抑制劑這一類非甾體抗炎藥的作用靶點(diǎn)，結(jié)果表明其主要與人們所熟知的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)微管蛋白和熱休克蛋白27(Hsp27)結(jié)合[5]。這些研究為今后開發(fā)具有潛力的微管蛋白抑制劑提供了新的方向。吲哚美辛(Indomethacin，IN)作為抗炎、抗風(fēng)濕和解熱鎮(zhèn)痛的一類非甾體抗炎藥，因具有一定的抗腫瘤作用而備受廣大學(xué)者關(guān)注[6]。臨床研究表明，吲哚美辛對(duì)乳腺癌[7]、皮膚鱗癌[8]、結(jié)腸癌[3]、胃癌[9-10]、肝癌[11]等患者的免疫功能都有積極的作用。Mercadante等[12-13]曾報(bào)道吲哚美辛可以減輕晚期癌癥患者發(fā)熱引起的疼痛。但目前臨床上主要采用非甾體抗炎藥與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤[14-16]。根據(jù)Temporelli等[17]學(xué)者報(bào)道，非甾體抗炎藥在臨床疾病的治療中可能會(huì)引起一系列心血管不良反應(yīng)，幾年前意大利藥物署(AIFA)也曾警告，對(duì)于患有嚴(yán)重心血管疾病如心臟衰竭的患者，應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用非甾體抗炎藥。因此，本課題以吲哚美辛為先導(dǎo)物，試圖保留吲哚母核和5位的甲氧基結(jié)構(gòu)，通過(guò)兩步酰化反應(yīng)得1位苯甲酰和3位羧基側(cè)鏈有不同大小、極性基團(tuán)取代的目標(biāo)化合物1～12，尋求具有高微管蛋白親和性、高腫瘤組織選擇性、低毒性的吲哚美辛衍生物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Varian Mercury-400型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，WRS-2型微機(jī)熔點(diǎn)測(cè)定儀(上海精密科學(xué)儀器公司)，LCQ Deca XP plus型離子阱質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)，SHZ-95B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州市亞榮儀器有限公司)，SHI-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司)，DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海右一儀器有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，超凈臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)，BIO-RAD酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè))，UV2300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(南京菲勒儀器有限公司)，人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29)，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)，人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2)，人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，四甲基偶氮唑藍(lán)MTT(Amresco分裝)，胰酶(Sigma公司)，胎牛血清(Sigma公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，DMSO，哌嗪-N,N-二(2-乙磺酸)倍半鈉鹽PIPES(Gibco公司)，高純度微管蛋白，EGTA，GTP，5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸，對(duì)溴苯甲酰氯，草酰氯均購(gòu)自百靈威科技有限公司，所用試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 中間體5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酰胺的合成 稱量5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸0.219 g(1 mmol)溶于15 mL干燥四氫呋喃中，冰水浴下滴加草酰氯(1.2 mmol)，滴加完畢，50 ℃回流1 h，旋干溶劑。稱量相應(yīng)的胺(1 mmol)溶于20 mL四氫呋喃，冰水浴下滴加上步制備的酰氯，并同時(shí)滴加3 mL三乙胺，室溫?cái)嚢? h，TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢，蒸干溶劑，乙酸乙酯萃取，水洗，5% NaCO3溶液洗，無(wú)水MgSO4干燥，柱色譜提純得中間體，收率69.0%～88.7%。

1.2.2 目標(biāo)化合物的合成 稱量中間體(0.35 mmol)溶于DMF，0～4 ℃下分批加入NaH 16.8 mg(0.70 mmol)，氬氣保護(hù)攪拌10 min，然后緩慢滴入對(duì)氯或?qū)︿灞郊柞Ｂ?0.4 mmol)，攪拌0.5 h，然后反應(yīng)液用20 mL碳酸氫鈉溶液驟冷，并用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取。有機(jī)層減壓濃縮，柱色譜提純得目標(biāo)化合物1～12，收率45.5%～79.1%(合成路線見(jiàn)圖1)。

N-苯基-2-(1-(4-氯苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(1)：白色固體，收率45.5%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.74(2H，d，J=8.4 Hz)，7.56(2H，d，J=8.0 Hz)，7.40(2H，d，J=7.6 Hz)，7.28(3H，m)，7.08(1H，t，J=7.6 Hz)，6.95(1H，s)，6.71(1H，d，J=7.2 Hz)，5.72(1H，s，-CONH-)，3.81(5H，s)，2.46(3H，s)；13CNMR(100 MHz DMSO-d6)δ(ppm)：169.2，168.5，156.3，139.8，138.3，136.1，134.9，131.8，131.8，131.6，131.0，131.0，129.7，129.7，129.4，124.0，119.9，119.9，115.3，114.8，111.8，102.6，56.1，31.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C25H22CIN2O3)[M+H]+:433.13，found:433.24。

圖1 目標(biāo)化合物合成路線

N-(3-甲氧基苯基)-2-(1-(4-氯苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(2)：白色粉末，收率57.3%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.74(2H，d，J=8.4 Hz)，7.56(2H，d，J=8.0 Hz)，7.31(2H，d，J=7.6 Hz)，7.26(1H，d，J=7.4 Hz)，6.95(1H，s)，6.87(2H，d，J=7.2 Hz)，6.71(1H，d，J=8.4 Hz)，5.71(1H，s，-CONH-)，3.81(3H，s)，3.79(2H，s)，3.77(3H，s)，2.45(3H，s)；13CNMR(100MHz DMSO-d6)δ(ppm)：169.2，168.5，156.2，155.7，138.3，136.1，134.9，132.9，132.9，131.8，131.6，130.9，130.9，129.7，121.5，121.5，115.2，115.2，114.9，114.5，111.8，102.6，56.1，55.8，32.6，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C26H24CIN2O4)[M+H]+:463.14，found:463.26。

N-(4-氯苯基)-2-(1-(4-氯苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(3)：白色固體，收率72.3%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.74(2H，d，J=8.4 Hz)，7.56(2H，d，J=8.0 Hz)，7.41(2H，d，J=7.6 Hz)，7.32(3H，m)，6.95(1H，s)，6.71(1H，d，J=8.4 Hz)，5.72(1H，s，-CONH-)，3.81(5H，s)，2.46(3H，s)；13CNMR(100MHz DMSO-d6)δ(ppm)：169.3，168.5，156.2，138.7，138.3，136.1，134.9，131.8，131.5，131.5，130.9，129.7，129.7，129.3，129.3，127.5，121.4，121.4，115.3，114.6，111.8，102.6，56.1，32.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C25H21Cl2N2O3)[M+H]+:467.09，found:467.21。

N-(4-溴苯基)-2-(1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(4)：淡黃色固體，收率74.4%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.74(2H，d，J=8.4 Hz)，7.56(2H，d，J=8.0 Hz)，7.45(4H，m)，7.26(1H，d，J=7.4 Hz)，6.96(1H，s)，6.71(1H，d，J=8.4 Hz)，5.72(1H，s，-CONH-)，3.81(5H，s)，2.45(3H，s)；13CNMR(100MHz DMSO-d6)δ(ppm)：169.3，168.5，156.2，138.7，138.3，137.1，134.9，132.1，132.1，131.5，131.5，130.9，129.7，129.7，127.5，122.9，122.9，120.8，115.3，114.6，111.8，102.6，56.1，32.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C25H22CIN2O3)[M+H]+:511.04，found:511.17。

N-芐基-2-(1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(5)：白色粉末，收率65.8%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：8.4(1H，s，-CONH-)，7.74(2H，d，J=8.4 Hz)，7.56(2H，d，J=8.0 Hz)，7.29(4H，m)，7.18(2H，d，J=7.4 Hz)，6.95(1H，s)，6.70(1H，d，J=8.0 Hz)，4.39(2H，d，J=4.8Hz)，3.80(5H，s)，2.45(3H，s)；13CNMR(100MHz DMSO-d6)δ(ppm)：169.2，168.5，156.3，139.8，137.7，136.1，134.9，131.8，131.8，131.6，131.0，131.0，129.4，129.0，129.0，125.2，125.2，122.7，115.3，114.8，111.8，102.6，56.1，52.3，31.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C26H24ClN2O3)[M+H]+:447.15，found:447.31。

N-苯乙基-2-(1-(4-氯苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(6)：白色固體，收率79.1%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：8.1(1H，s，-CONH-)，7.74(2H，d，J=8.4 Hz)，7.56(2H，d，J=7.6 Hz)，7.31(1H，d，J=7.6 Hz)，7.11-7.19(5H，m)，6.95(1H，s)，6.70(1H，d，J=8.0 Hz)，3.80(5H，s)，3.35(2H，q)2.45(5H，m)；13CNMR(100MHz DMSO-d6)δ(ppm)：169.2，168.5，156.3，139.7，138.3，136.1，134.9，129.7，129.7，129.4，128.1，128.1，127.2，127.2，125.4，124.0，119.9，119.9，115.3，114.8，111.8，102.6，56.1，37.7，35.3，31.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C27H26ClN2O3)[M+H]+:461.18，found:461.37。

N-苯基-2-(1-(4-溴苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(7)：白色固體，收率48.7%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.76(2H，d，J=8.0 Hz)，7.62(2H，d，J=7.6 Hz)，7.40(2H，d，J=7.6 Hz)，7.28(3H，m)，7.08(1H，t，J=7.6 Hz)，6.95(1H，s)，6.71(1H，d，J=7.2 Hz)，5.72(1H，s，-CONH-)，3.81(5H，s)，2.46(3H，s)；13CNMR(100 MHz DMSO-d6)δ(ppm)：169.4，168.5，156.3，138.3，136.1，134.9，132.6，132.6，132.6，132.6，132.3，129.7，129.7，129.4，128.6，124.0，119.9，119.9，115.3，114.8，111.8，102.6，56.1，31.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C25H22BrN2O3)[M+H]+:477.09，found:477.23。

N-(3-甲氧基苯基)-2-(1-(4-溴苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(8)：白色固體，收率65.3%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.76(2H，d，J=8.0 Hz)，7.63(2H，d，J=7.6 Hz)，7.31(2H，d，J=7.6 Hz)，7.26(1H，d，J=7.4 Hz)，6.95(1H，s)，6.87(2H，d，J=7.2 Hz)，6.71(1H，d，J=8.4 Hz)，5.71(1H，s，-CONH-)，3.81(3H，s)，3.79(2H，s)，3.77(3H，s)，2.45(3H，s)；13CNMR(100 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：169.4，168.5，156.2，155.7，136.1，134.9，132.6，132.6，132.6，132.6，132.3，131.6，129.7，128.6，121.5，121.5，115.2，115.2，114.9，114.5，111.8，102.6，56.1，55.7，32.6，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C26H24BrN2O4)[M+H]+:507.10，found:507.31。

N-(4-氯苯基)-2-(1-(4-溴苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(9)：白色固體，收率61.8%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.76(2H，d，J=8.0 Hz)，7.62(2H，d，J=8.0 Hz)，7.41(2H，d，J=7.6 Hz)，7.32(3H，m)，6.95(1H，s)，6.71(1H，d，J=8.4 Hz)，5.72(1H，s，-CONH-)，3.81(5H，s)，2.46(3H，s)；13CNMR(100 MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：169.3，168.5，156.2，138.3，136.1，134.9，131.8，132.6，132.6，132.6，132.6，132.3，129.3，129.3，128.6，127.5，121.4，121.4，115.3，114.6，111.8，102.6，56.1，32.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C25H22CIN2O3)[M+H]+:512.81，found:512.99。

N-(4-溴苯基)-2-(1-(4-溴苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(10)：淡黃色固體，收率64.4%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：7.76(2H，d，J=8.0 Hz)，7.62(2H，d，J=7.6 Hz)，7.45(4H，m)，7.26(1H，d，J=7.4 Hz)，6.96(1H，s)，6.71(1H，d，J=8.4 Hz)，5.72(1H，s，-CONH-)，3.81(5H，s)，2.45(3H，s)；13CNMR(100 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：169.4，168.5，156.2，138.3，137.1，134.9，132.6，132.6，132.6，132.6，132.3，132.1，132.1，128.6，127.5，122.9，122.9，120.8，115.3，114.6，111.8，102.6，56.1，32.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C25H21Br2N2O3)[M+H]+:554.98，found:555.15。

N-芐基-2-(1-(4-溴苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(11)：白色固體，收率70.9%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：8.4(1H，s，-CONH-)，7.76(2H，d，J=8.0 Hz)，7.62(2H，d，J=7.6 Hz)，7.31(4H，m)，7.18(2H，d，J=7.4 Hz)，6.96(1H，s)，6.70(1H，d，J=8.0 Hz)，4.39(2H，d，J=4.8Hz)，3.80(5H，s)，2.45(3H，s)；13CNMR(100 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：169.4，168.5，156.3，137.7，136.1，134.9，132.6，132.6，132.6，132.6，132.3，129.4，129.0，129.0，128.6，125.2，125.2，122.7，115.3，114.8，111.8，102.6，56.1，52.3，31.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C26H24BrN2O3)[M+H]+:491.10，found:491.39。

N-苯乙基-2-(1-(4-溴苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-)乙酰胺(12)：白色固體，收率77.4%；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：8.1(1H，s，-CONH-)，7.76(2H，d，J=8.0 Hz)，7.62(2H，d，J=7.6 Hz)，7.31(1H，d，J=7.6 Hz)，7.11-7.19(5H，m)，6.95(1H，s)，6.70(1H，d，J=8.0 Hz)，3.80(5H，s)，3.35(2H，q)2.45(5H，m)；13CNMR(100 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：169.4，168.5，156.3，138.3，136.1，134.9，132.6，132.6，132.6，132.6，132.3，129.7，129.7，129.4，128.6，124.0，119.9，119.9，115.3，114.8，111.8，102.6，56.1，37.7，35.3，31.7，14.1；ESI-MSm/z:calculated for(C27H26BrN2O3)[M+H]+:505.11，found:505.44。

2 體外生物活性探究

2.1 抗腫瘤活性 采用MTT法探究了12種目標(biāo)化合物的抗腫瘤增殖活性，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29、A549、Hep-2、MCF-7細(xì)胞，100 μL濃度為4 000～5 000個(gè)/μL細(xì)胞液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，90%濕度、5% CO2、37 ℃孵育24 h。加入預(yù)先配好的不同濃度的目標(biāo)化合物，空白對(duì)照組加入等量的細(xì)胞液，每組濃度設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照，混勻，90%濕度、5% CO2、37 ℃孵育48 h。顯微鏡觀察不同濃度作用的細(xì)胞形態(tài)變化，待藥物與細(xì)胞充分作用后，每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，然后每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻15 min，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照)×100%，SPSS軟件計(jì)算IC50值，結(jié)果見(jiàn)表1。不同濃度目標(biāo)化合物12作用于HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞48 h后，與空白組相比，0.5、5、50 μmol組均出現(xiàn)了較多的凋亡小體，隨著濃度的增大，凋亡小體的數(shù)量增加，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度化合物12對(duì)HT29的生長(zhǎng)抑制作用

化合物微管蛋白IC50(μmol/L)HT29Hep-2MCF-7A549Indomethacin1682±129935±851136±62971±821692±7111299±101854±92924±271214±1091417±1152693±50201±17232±11219±16351±21322±949±563±1361±395±7416±3.223±3.529±421±645±115201±35115±15132±17144±8149±1768.8±2.119±829±634±1337±47934±120711±52837±48816±261020±1078809±65123±24156±16152±15191±23911±1.939±744±641±659±3.41015±6.311±4.916±4.513±4.116±51189±9.8109±11127±12111±9135±17125.6±0.52.2±0.83.9±0.62.8±0.45.1±1.1

2.2 微管蛋白的抑制 取200 μL微管蛋白(2 mg/mL，來(lái)源于牛腦，溶于pH 6.9的80 mmol PIPES)，2 mmol MgCl2、0.5 mmol EGTA、5%甘油、1 mmol GTP加入96孔板中，再加入DMSO配制的不同濃度目標(biāo)化合物溶液，采用DMSO作為空白對(duì)照，37 ℃孵育，紫外分光光度計(jì)340 nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)20 min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，抑制率計(jì)算公式如下，抑制率(%)=(1-A樣品/A空白)×100%。

3 討論

由于近年來(lái)COX-2抑制劑被廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤疾病的治療中，因此采用吲哚美辛為先導(dǎo)物，通過(guò)羧基側(cè)鏈和苯甲?；鶄?cè)鏈的結(jié)構(gòu)改造尋求高效低毒的吲哚類抗腫瘤藥物。綜合考慮電性、疏水性、氫鍵等因素，改變側(cè)鏈取代基如鹵素、甲氧基、甲基等供電子基團(tuán)，確定吲哚類抗腫瘤藥物對(duì)取代基和官能團(tuán)的要求。以5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸為起始原料，經(jīng)兩步酰化反應(yīng)獲得12種吲哚美辛衍生物。MTT法檢測(cè)了目標(biāo)化合物對(duì)HT29、A549、Hep-2、MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制活性，同時(shí)顯微鏡觀察了細(xì)胞形態(tài)的變化。本研究所設(shè)計(jì)合成的目標(biāo)化合物均具有強(qiáng)于先導(dǎo)化合物吲哚美辛的抗腫瘤活性，1位苯甲酰側(cè)鏈連接不同鹵素和3位羧基側(cè)鏈連接的不同長(zhǎng)度取代基引起了各異的腫瘤細(xì)胞抑制活性，如表1所示，1位苯甲酰對(duì)位以溴取代如目標(biāo)化合物7～12(IC50=2.2～1 020 μmol)顯示了優(yōu)于氯取代化合物1～6(IC50=21～1 417 μmol)的抗腫瘤活性。當(dāng)改變3位羧基側(cè)鏈取代基抑制活性同樣也引起了顯著差異，與苯基取代的化合物1(IC50=854 μmol)和7(IC50=711 μmol)相比，化合物5、6和11、12表現(xiàn)了較好的作用效果，其中化合物6和12作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50分別為19 μmol和2.2 μmol，推測(cè)主要原因?yàn)檠娱L(zhǎng)側(cè)鏈長(zhǎng)度增加了分子柔性，改變構(gòu)象，使其形成更有利于與微管蛋白作用的空間結(jié)構(gòu)。另外，12種目標(biāo)化合物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞顯示了不同程度的抑制作用，但對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29表現(xiàn)了高度的選擇性，為后期進(jìn)一步探究抗腫瘤機(jī)制提供了明確的方向。1位苯甲酰對(duì)位溴取代和3位羧基側(cè)鏈苯乙基取代的目標(biāo)化合物12呈現(xiàn)了最強(qiáng)的HT29抑制活性，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。

為了進(jìn)一步探究目標(biāo)化合物的抗腫瘤機(jī)制和探索其是否影響微管蛋白聚合作用。采用濁度法[18]檢測(cè)了目標(biāo)化合物體外微管蛋白抑制活性。如表1所示，12種目標(biāo)化合物對(duì)微管聚合均有影響，作用于微管蛋白的IC50為5.6～1 299 μmol，表現(xiàn)出優(yōu)于吲哚美辛(IC50=1 682 μmol)的抑制效果。其中3位羧基側(cè)鏈苯乙基取代目標(biāo)化合物6和12對(duì)微管聚合的影響最為明顯，IC50分別為8.8 μmol和5.6 μmol，且體外抑制率與其濃度呈正相關(guān)的關(guān)系，目標(biāo)化合物作為微管蛋白抑制劑，通過(guò)損壞微管結(jié)構(gòu)來(lái)干擾微管聚合，從而破環(huán)微管聚合的動(dòng)態(tài)平衡，阻斷腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。與傳統(tǒng)的硝酸酯類NO供體型衍生物相比，本項(xiàng)研究通過(guò)改變側(cè)鏈取代基的電性、疏水性等因素形成與靶向微管蛋白具有較好結(jié)合能力的空間構(gòu)象，并且兩步綠色環(huán)保、易操作、價(jià)格低廉的?；磻?yīng)即可獲得12種目標(biāo)化合物，3位羧基側(cè)鏈苯乙基取代目標(biāo)化合物6和12體現(xiàn)了不同于組胺-吲哚美辛、吲哚美辛-5氟尿嘧啶、硝酸酯類等衍生物的HT29抗腫瘤活性和微管蛋白抑制活性。綜合考慮體外腫瘤細(xì)胞和微管蛋白抑制試驗(yàn)結(jié)果，目標(biāo)化合物6和12有較強(qiáng)的體外HT29、A549、Hep-2、MCF-7細(xì)胞增殖抑制活性與其具有顯著的干擾微管聚合的作用密不可分，這對(duì)今后探究吲哚美辛衍生物抗腫瘤機(jī)制有著一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，3位羧基側(cè)鏈苯乙基取代的吲哚美辛衍生物具有良好的體外抗腫瘤潛力，可能是通過(guò)影響微管蛋白聚合發(fā)揮其腫瘤抑制活性，為開發(fā)以微管為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Synthesis and anticancer activity of indomethacin analogues targeting tubulin

YAN Bao-hong,CHANG Yu

(Department of Pharmacy,Xi′an Honghui Hospital,Xi′an 710049,China)

Objective To design and synthesize a series of indomethacin derivatives,and to evaluate the activity of antitumor and tubulin interfering.Methods The target compounds were synthesized through two acylation using 5-methoxy-2-methyl-3-indoleacetic acid as starting material.The antitumor activities against HT29,A549,Hep-2 and MCF-7 were assayed by MTT.The turbidity method was used to evaluate the anti-tubulin activity.Results Inhibitory effects of most compounds on tumor cells and tubulin were higher than the positive control indomethacin.Moreover,the compound 12 was generated from substituted products with phenethyl at the 3rd position of the carboxyl,and showed the lowest IC50value of 2.2 μmol (400 times of indomethacin) against HT29 and 5.6 μmol against tubulin.Conclusion The indomethacin derivatives replaced by much flexible groups or polar groups at the position of amide and carboxyl chain are a novel and potential antitumor drug targeted on tubulin.

Tubulin;Indomethacin;Synthesis;Antitumor

2016-08-29

紅會(huì)醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710049

10.14053/j.cnki.ppcr.201705005