毛哲哲，陳奎利，王慧玲，程 忠，馮 強

燈盞花素對大鼠肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響及機制研究

毛哲哲*，陳奎利，王慧玲，程 忠，馮 強

目的 研究燈盞花素(Breviscapine，Bre)對大鼠肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡以及凋亡相關基因、蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制。方法 通過夾閉左肺門45 min的方法，建立大鼠肺缺血再灌注損傷模型，術前30 min，分別給予不同濃度燈盞花素(12.5、25、50 mg/kg)和舒血寧(4 mg/kg)，并設假手術組和模型組。再灌注2 h后，測定肺組織濕/干重比(W/D)，TUNEL法檢測肺細胞凋亡，RT-PCR法檢測肺組織中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達，比色法測定肺組織中抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量，Western blot法測定肺組織中NF-κB蛋白表達。結果 與模型組比較，經(jīng)燈盞花素干預能夠顯著降低肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織W/D，減輕肺水腫，降低肺細胞凋亡指數(shù)(AI)，改善肺細胞凋亡狀況，上調(diào)bcl-2 mRNA表達，下調(diào)Bax mRNA表達，提高bcl-2/Bax比值，改善抗氧化酶(SOD、CAT)活性，降低MDA含量，下調(diào)NF-κB蛋白表達，上述作用均具有一定劑量依賴性。結論 燈盞花素可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關基因、蛋白表達而對肺缺血再灌注損傷大鼠肺細胞凋亡起到抑制作用，對肺缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。

燈盞花素；肺缺血再灌注；凋亡；機制

0 引言

燈盞花是菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，又名燈盞細辛，為我國傳統(tǒng)中藥品種，首載于《滇南本草》，其性寒、微苦、甘溫辛，具有祛風除濕、活血化瘀、通經(jīng)活絡、消炎止痛之功效。燈盞花素(Breviscapine，Bre)是燈盞花的主要活性成分，現(xiàn)代藥學研究發(fā)現(xiàn)，Bre屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、改善血液循環(huán)等多種生物學活性[1-4]。Bre對腦組織、心肌、腎臟、肝臟等組織器官缺血再灌注損傷均具有一定的保護作用[4-7]，但Bre是否對肺缺血再灌注損傷具有保護作用尚未見文獻報道。本研究采用夾閉左肺門45 min后恢復血流灌注的方法，制備大鼠肺缺血再灌注模型，研究Bre對肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響，探討B(tài)re對肺缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 120只實驗用SD大鼠(雄性，清潔級，鼠齡6～7周，體重200～240 g)，購自河北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 試驗藥物與試劑 燈盞花素注射液購自石藥銀湖制藥有限公司(批號：1011411024)；舒血寧注射液購自神威藥業(yè)有限公司(批號：20131126)；TUNEL試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；bcl-2、Bax上下游引物購自上海博亞生物公司；NF-κB單體購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與模型的制備 將120只實驗用SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為假手術組、模型組、燈盞花素(12.5、25、50 mg/kg)組和舒血寧(4 mg/kg)組，各20只；參照賈俊海等[6]報道的實驗方法制備大鼠肺缺血再灌注模型，假手術組大鼠行手術通路而不夾閉血管。各治療組分別于術前30 min腹腔注射給藥，假手術組和模型組同步給予等體積生理鹽水；再灌注2 h后，取標本行各指標檢測。

1.3.2 肺組織濕/干比重(W/D)的測定 每組隨機取6只大鼠，麻醉后取肺組織稱重為濕重(W)，置60 ℃烘箱24 h后稱重為干重(D)，然后計算W/D。

1.3.3 細胞凋亡狀況觀察 每組隨機取6只大鼠，麻醉后開胸取肺組織，置于4%多聚甲醛溶液進行固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)脫蠟水化、TUNEL染色和封片處理后，通過顯微鏡觀察肺組織細胞凋亡狀況并照相保存。計算細胞凋亡指數(shù)(Apoptosis index，AI)：每張染色切片于相同位置取6個不重疊的視野，分別計數(shù)每個視野中總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)，然后計算AI∶AI(%)=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.3.4 bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達的檢測 首先查閱并設計大鼠bcl-2、Bax、β-actin上下游引物序列；每組剩余8只大鼠麻醉后取肺組織，研磨勻漿，提取總RNA并測定濃度，取1 μg RNA進行反轉錄后行PCR擴增反應，取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像儀觀察并照相；以β-actin為內(nèi)參，以灰度值進行半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達并計算bcl-2/Bax比值。

1.3.5 肺組織抗氧化酶活性和MDA含量的測定 取肺組織勻漿液，經(jīng)3 500 r/min離心10 min后取上清液，通過紫外-可見分光光度計測定抗氧化酶(SOD、CAT)活性和MDA含量。

1.3.6 肺組織中NF-κB蛋白表達的檢測 取肺組織勻漿液，低溫離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)后取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，進行蛋白變性(沸水浴加熱5 min)、上樣(每孔上樣30 μg)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉PVDF膜、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4 ℃過夜，洗膜，二抗(1∶100)室溫孵育1 h后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯影；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值測定NF-κB相對表達量。

2 結果

2.1 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D的影響 結果如表1所示。模型組大鼠肺組織W/D較假手術組顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，Bre(25、50 mg/kg)或舒血寧(4 mg/kg)預處理能顯著降低肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織W/D值(P<0.05，P<0.01)。Bre(12.5、25、50 mg/kg)組W/D值與舒血寧組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺細胞凋亡狀況的影響 各組大鼠肺組織細胞凋亡狀況如圖1所示。模型組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù)量較假手術組明顯增多；與模型組比較，Bre各濃度組和舒血寧組肺組織凋亡細胞數(shù)量呈不同程度減少，該作用具有一定的劑量依賴性。AI結果如表1所示。模型組大鼠肺組織細胞AI較假手術組顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，Bre(25、50 mg/kg)或舒血寧(4 mg/kg)預處理能夠顯著降低肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細胞AI值(P<0.05，P<0.01)。與舒血寧組比較，Bre 50 mg/kg組大鼠肺組織細胞AI顯著降低(P<0.05)。

2.3 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及bcl-2/Bax比值的影響 結果見表2。模型組大鼠肺組織中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達較假手術組顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，Bre(25、50 mg/kg)或舒血寧預處理能夠顯著上調(diào)肺缺血再灌注大鼠肺組織bcl-2 mRNA表達(P<0.05，P<0.01)，下調(diào)Bax mRNA表達(P<0.05，P<0.01)，并顯著提高bcl-2/Bax比值(P<0.01)。與舒血寧4 mg/kg組比較，Bre 50 mg/kg組bcl-2 mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05)、bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)，而Bax mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺細胞凋亡狀況的影響

表1 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織W/D和細胞凋亡率的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與舒血寧組比較，#P<0.05

2.4 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織中SOD、CAT活性和MDA含量的影響 結果如表3所示。模型組大鼠肺組織中SOD、CAT活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，Bre(25、50 mg/kg)預處理能夠顯著提高肺缺血再灌注大鼠肺組織中SOD、CAT活性(P<0.05，P<0.01)，并顯著降低MDA含量(P<0.01)；經(jīng)舒血寧(4 mg/kg)預處理，能夠顯著提高SOD活性，并顯著降低MDA含量(P<0.05)，CAT活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與舒血寧4 mg/kg組比較，Bre 50 mg/kg組SOD、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

2.5 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織NF-κB蛋白表達的影響 結果如圖2和表4所示。模型組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，Bre(25、50 mg/kg)或舒血寧(4 mg/kg)預處理能夠顯著下調(diào)肺缺血再灌注大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。與舒血寧4 mg/kg組比較，Bre 50 mg/kg組NF-κB蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)。

表2 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及bcl-2/Bax比值的影響

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01；與舒血寧組比較，#P<0.05

表3 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織中SOD、CAT活性和MDA含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與舒血寧組比較，#P<0.05

圖2 Bre對肺缺血再灌注大鼠肺組織NF-κB蛋白表達的影響

組別只數(shù)NF-κB/β-actin假手術組80.17±0.06模型組80.45±0.13△△Bre12.5mg/kg組80.41±0.11Bre25mg/kg組80.38±0.07*Bre50mg/kg組80.20±0.05**##舒血寧4mg/kg組80.37±0.09*

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與舒血寧組比較，##P<0.01

3 討論

肺部手術過程中往往需要阻斷血流以減少出血，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥的存在嚴重影響著患者的預后。肺缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展具有非常復雜的病理機制，其中繼發(fā)性肺細胞凋亡發(fā)揮著重要作用[8]。因此，以抑制細胞凋亡為切入點研發(fā)新藥物，或許是改善肺缺血再灌注損傷的有效途徑。

Bre是一種具有抗炎、抗氧化、改善血液循環(huán)等多種藥理學作用的黃酮類化合物[1-4]。舒血寧的活性成分為銀杏葉提取物，具有抗氧化、抑制細胞凋亡、降血脂等多種藥理學作用[9-11]，臨床上廣泛應用于腦部、周圍血流循環(huán)障礙性疾病。既往研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能夠通過降低氧化應激損傷、抑制細胞凋亡而對肺缺血再灌注損傷起到明顯的保護作用[12-14]。本實驗通過夾閉左肺門45 min后恢復血流的方法建立肺缺血再灌注損傷大鼠模型，給予不同劑量燈盞花素(12.5、25、50 mg/kg)進行干預治療，以舒血寧為陽性對照藥物，研究燈盞花素對大鼠肺缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響，并初步探討其量-效關系。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Bre(25～50 mg/kg)預處理，能夠顯著緩解肺缺血再灌注損傷大鼠肺水腫、抑制肺細胞凋亡(P<0.05，P<0.01)，Bre 50 mg/kg組肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織W/D和AI均低于Bre 25 mg/kg組，且Bre 50 mg/kg組AI顯著低于舒血寧4 mg/kg組(P<0.05)，提示Bre對肺缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡具有劑量依賴性的抑制作用，表現(xiàn)出Bre對肺缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

細胞凋亡是一種由多種基因參與調(diào)控的程序化死亡過程，其中bcl-2基因家族起著非常重要的調(diào)控作用。bcl-2能夠抑制線粒體破裂，并可直接與凋亡刺激因子結合而抑制促凋亡蛋白caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax細胞毒性作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度，從而起到抑制細胞凋亡的作用；Bax也屬于bcl-2基因家族成員，它能夠誘導線粒體滲透性改變而釋放細胞色素C，激活促凋亡蛋白caspase-9，而表現(xiàn)出促細胞凋亡作用[15]。此外，Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性而促進細胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)bcl-2基因家族對細胞凋亡的調(diào)控作用[16]，Bax/bcl-2比值越高，往往凋亡狀況越嚴重。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Bre(25～50 mg/kg)預處理，能夠顯著上調(diào)肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織bcl-2表達，并下調(diào)Bax表達、提高bcl-2/Bax比值(P<0.05，P<0.01)；并且Bre 50 mg/kg組bcl-2 mRNA表達較舒血寧4 mg/kg組顯著升高，bcl-2/Bax比值更高(P<0.05)，這可能是Bre誘導肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細胞凋亡重要的分子機制之一。

氧化應激損傷是細胞凋亡最重要的誘發(fā)因素之一，常態(tài)下體內(nèi)氧自由基(ROS)的生成與清除處于動態(tài)平衡，其中抗氧化酶SOD、CAT對ROS的清除發(fā)揮著重要的催化作用[17]；而當缺血實現(xiàn)再灌注后，隨著氧的大量涌入，ROS大量生成和過剩而攻擊細胞膜，造成臟器的脂質過氧化損傷，因此，脂質過氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映氧化應激損傷程度。NF-κB被稱為連接氧化應激損傷和細胞凋亡的“橋梁”[18-19]，常態(tài)下NF-κB無活性，當細胞受到ROS攻擊時，NF-κB將被活化而促進巨噬細胞活化和浸潤，誘導促凋亡信號釋放而導致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Bre(25～50 mg/kg)預處理，能夠顯著改善肺缺血再灌注大鼠肺組織SOD、CAT活性，并顯著降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)，顯著下調(diào)NF-κB蛋白表達(P<0.05，P<0.01)；并且Bre 50 mg/kg組SOD、CAT活性較舒血寧4 mg/kg組顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，提示Bre具有抑制肺缺血再灌注大鼠氧化應激損傷的作用，這可能是Bre抑制細胞凋亡的重要機制之一。

綜上所述，Bre具有劑量依賴性抑制肺缺血再灌注損傷大鼠肺細胞凋亡的作用，表現(xiàn)出對肺缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，其機制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關基因表達(上調(diào)bcl-2表達、下調(diào)Bax表達，提高bcl-2/Bax比值)和相關蛋白表達(下調(diào)NF-κB蛋白表達)、改善抗氧化酶活性而抑制氧化應激損傷有關。

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Effects and mechanism of breviscapine on cell apoptosis in the rats with pulmonary ischemia-reperfusion injury

MAO Zhe-zhe*,CHEN Kui-li,WANG Hui-ling,CHENG Zhong,FENG Qiang

(Handan Central Hospital of Hebei,Handan 056001,China)

Objective To investigate the effects of breviscapine on lung cell apoptosis,the expression of apoptosis-related genes and protein in the rats with pulmonary ischemia-reperfusion injury,and to explore its possible mechanism.Methods The pulmonary ischemia-reperfusion model rats were made by clipping left lung door for 45 min and were treated with Bre (12.5,25,50 mg/kg) and Shuxuening (4 mg/kg) at 30 min before the operation,and the sham operation group and model group were set up.Two hours after reperfusion,the wet/dry (W/D) ratio of lung tissue was examined;the apoptosis of lung tissue cells were observed by TUNEL staining;the expression of bcl-2 mRNA and Bax mRNA in lung tissue was determined;the activity of antioxidase and the content of MDA in lung tissue were determined;the expression of NF-κB in lung tissue was determined by Western blot.Results Compared with model group,the lung tissue W/D of the rats in Bre-treated groups was significantly decreased,the AI was significantly decreased and the lung cells apoptosis was significantly improved;the expression of bcl-2 mRNA was significantly up-regulated and the Bax mRNA was significantly down-regulated;the ratio of bcl-2/Bax was significantly increased;the activity of SOD and CAT in lung tissue were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased;the expression of NF-κB protein was significantly decreased;all of the effects above-mentioned were some dose-dependent.Conclusion Bre has inhibitive effects on lung cells apoptosis through altering the expression of apoptosis-related genes and protein,which suggests that Bre has protective effects on the rats with pulmonary ischemia-reperfusion injury.

Breviscapine;Pulmonary ischemia-reperfusion;Apoptosis;Mechanism

2016-08-11

河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201705002