陳昌國 侯兵兵 陳秋圓 郭建巍 趙強(qiáng)元

臨床研究

Taqman-探針熒光定量PCR鑒定溶藻弧菌方法的建立

陳昌國 侯兵兵 陳秋圓 郭建巍 趙強(qiáng)元

目的 建立一種基于DNA回旋酶B亞單位基因（gyrB）基因的Taqman-探針熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定溶藻弧菌的方法。方法 以溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC）和溶藻弧菌野生株（WT）為研究對象，通過軟件設(shè)計(jì)溶藻弧菌gyrB基因的特異性PCR引物及Taqman-探針，采用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，評價(jià)該檢測方法的特異性和靈敏度。結(jié)果 Taqman-探針熒光定量PCR檢測方法對溶藻弧菌gyrB基因的檢測靈敏度為10-3mg/L；在檢測糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏腸桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌6種其他常見致病菌時未出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，特異性均為100%。結(jié)論 成功建立Taqman-探針熒光定量PCR是一種特異性、靈敏度均較好的鑒定溶藻弧菌的方法，該方法適用于溶藻弧菌的快速檢測，具有應(yīng)用價(jià)值。

Taqman-探針； 熒光定量PCR； 溶藻弧菌； gyrB基因

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）由Miyamoto在1961年命名，屬弧菌科弧菌屬，是一種革蘭陰性（G-）嗜鹽性弧菌［1］，廣泛存在于海洋、河水等水體環(huán)境中，是水生動物弧菌病的主要條件致病菌［2-3］。對于人類，部分致病力較強(qiáng)的弧菌如創(chuàng)傷弧菌可以造成致命性感染［4］，溶藻弧菌主要導(dǎo)致食物中毒和胃腸炎，嚴(yán)重時可引起膿毒癥［5-6］。溶藻弧菌作為一種致腹瀉菌和影響食品安全的病原菌日益受到重視［7-8］。

溶藻弧菌常規(guī)檢測方法大多要經(jīng)過分離培養(yǎng)與生化鑒定，不僅用時較長且不能快速鑒別病原菌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病原菌的鑒定和檢測［9-10］。我們針對溶藻弧菌DNA回旋酶B亞單位基因（gyrB）高度保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量引物和Taqman-探針，建立Taqman-探針熒光定量PCR檢測溶藻弧菌的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)使用的菌株包括：溶藻弧菌ATCC-17749（由李艷君博士提供）；溶藻弧菌野生株-WT（由本實(shí)驗(yàn)室采集并保存）；糞腸球菌ATCC-29212、金黃色葡萄球菌（金葡菌）ATCC-25293、腐生葡萄球菌ATCC-BAA750、銅綠假單胞菌ATCC-27853、霍氏腸桿菌ATCC-700323、大腸埃希氏菌ATCC-25922菌株6種其他菌株均為本科室保存。

1.2 儀器與試劑 SYBR?Green QPCR Master Mix購自天根生物科技（北京）有限公司；熒光定量PCR儀為上海宏石公司SLAN-96P Real Time PCR System生產(chǎn)，引物及Taqman-探針由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，按照引物合成單要求進(jìn)行后期處理。

1.3 細(xì)菌核酸粗提物制備 菌種存放在-80 ℃的冰箱里，取出后置于37 ℃水浴快速復(fù)溫，復(fù)溫后的菌種凍存液接種在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）和哥倫比亞血平板上，在37 ℃孵箱中培養(yǎng)12 h。用無菌接種環(huán)取適量細(xì)菌至1.5 mL離心管中，加入100 μL核酸裂解液后室溫裂解15 min，100 ℃恒溫金屬浴加熱10 min，室溫13 000 r/min離心5 min（離心半徑＝9.5 cm），取上清作為模板。

1.4 引物及Taqman-熒光探針設(shè)計(jì) 在NCBI網(wǎng)站輸入基因名稱獲取相應(yīng)基因序列，運(yùn)用生物軟件Beacon Designer 7和 Primer Premier 5.0進(jìn)行熒光定量PCR引物及Taqman-熒光探針設(shè)計(jì)，探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記BHQ1。上游引物：5'-GCT AACACGTACATTGA-3'，下游引物：5'-GCTTGAG AACTTAGGATCA-3'，熒光探針：FAM-CCGCAGTT AGACCTTCACGC-BHQ1。

1.5 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 取1 μL提取液上清為模板，以gyrB特異性引物及Taqman-探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為：2× Mix 10 μL、引物對1 μL、模板1 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min（94 ℃ 30 s～58 ℃ 40 s收集熒光），35個循環(huán)，25 ℃ 10 s。

1.6 引物濃度的優(yōu)化 上下游引物濃度分別配置成20 nmol/L、15 nmol/L、10 nmol/L工作液進(jìn)行熒光定量PCR檢測，擴(kuò)增條件同前。

1.7 探針濃度的優(yōu)化 合成的熒光探針按照合成單加入ddH2O配成母液，然后取5 μL探針母液至95 μL ddH2O中作為工作液。在20 μL PCR反應(yīng)體系中分別加入1 μL、0.5 μL熒光探針，擴(kuò)增條件同前。

1.8 特異性評價(jià) 以優(yōu)化后的反應(yīng)體系檢測溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其他6種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)株。

1.9 靈敏度評價(jià) 以標(biāo)準(zhǔn)菌株系列濃度梯度為模板（102mg/L～10-5mg/L），每個濃度梯度取1 μL核酸為模板，以優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR。以出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線并在循環(huán)數(shù)內(nèi)出現(xiàn)Ct值為陽性。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 引物濃度的優(yōu)化 經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)引物最佳濃度約為10 nmol/L，經(jīng)2%凝膠電泳顯示引物二聚體較少且擴(kuò)增效率能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物2%凝膠電泳圖

2.1.2 探針濃度的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20 μL PCR反應(yīng)體系中加入0.5 μL熒光探針，其反應(yīng)曲線較加入1 μL熒光探針的效果更好，見圖2。優(yōu)化后的溶藻弧菌Taqman-探針熒光定量PCR反應(yīng)條件為：20 μL體系（ddH2O 7.5 μL、2× Mix 10 μL、模板1 μL、引物對1 μL、探針0.5 μL），95 ℃ 5 min（94 ℃ 30 s～58 ℃ 40 s收集熒光），35個循環(huán)，25 ℃ 10 s。

2.2 Taqman-探針熒光定量PCR反應(yīng)體系評價(jià)

2.2.1 特異性評價(jià) 用優(yōu)化后的反應(yīng)體系檢測溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株與野生株以及其他6種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，以溶藻弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照。結(jié)果除溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株及野生株出現(xiàn)陽性擴(kuò)增外，其他6種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株均無陽性擴(kuò)增。因此，該方法的特異性為100%。見圖3～4。

圖2 不同濃度的探針PCR擴(kuò)增曲線

圖3 溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株與野生株以及其他6種細(xì)菌PCR擴(kuò)增曲線

注：1為溶藻弧菌ATCC-17749；2為溶藻弧菌野生株WT；3為糞腸球菌ATCC-29212；4為金黃色葡萄球菌ATCC-25293；5為腐生葡萄球菌ATCC-BAA750；6為霍氏腸桿菌ATCC-700323；7為銅綠假單胞菌ATCC-27853；8為大腸埃希氏菌ATCC-25922圖4 溶藻弧菌Taqman-探針熒光定量PCR特異度檢測

2.2.2 靈敏度評價(jià) 以溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株核酸系列稀釋樣本為模板進(jìn)行熒光定量PCR，當(dāng)模板濃度為102～10-3mg/L時，每個濃度均有典型擴(kuò)增曲線，當(dāng)模板濃度為10-4～10-5mg/L時，每個濃度未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。所以，本研究建立的方法對溶藻弧菌gyrB基因的檢測靈敏度為10-3mg/L，有較好的檢測靈敏度。見圖5～6。

圖5 溶藻弧菌（ATCC）Taqman-探針熒光定量PCR靈敏度檢測

圖6 溶藻弧菌（WT）Taqman-探針熒光定量PCR靈敏度檢測

3 討論

溶藻弧菌傳統(tǒng)的檢測方法檢測時間長且特異性和靈敏度均受到不同程度的限制。因此，建立快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測和鑒定方法是必要的。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，目前已經(jīng)有很多技術(shù)如PCR、SYBRGreen熒光定量PCR、隨機(jī)引物PCR、酶聯(lián)反應(yīng)吸附試驗(yàn)（ELISA）、斑點(diǎn)雜交以及多重?zé)晒釶CR等用于弧菌的檢測［10］。而分子分型技術(shù)以分辨率高、特異性強(qiáng)、重復(fù)率好的特點(diǎn)在弧菌感染的溯源及防控方面發(fā)揮了十分重要的作用［11-12］。Taqman-探針熒光定量PCR技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于病原菌檢測，該技術(shù)在普通PCR基礎(chǔ)上加入一條特異的熒光探針，因而較其他PCR方法具有更高的特異性［13］。本研究針對溶藻弧菌gyrB基因高度保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物和熒光探針，建立了Taqman-探針熒光定量PCR鑒定溶藻弧菌的體系，并對反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。

16S rRNA基因、colH基因、dnaJ40基因以及hsp60基因等都曾被應(yīng)用于溶藻弧菌的檢測［5］。其中，16S rRNA基因測序雖然是細(xì)菌分子系統(tǒng)鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對于一些種屬關(guān)系比較密切的細(xì)菌（如弧菌屬、氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬和分枝桿菌屬）缺乏足夠的鑒辨能力［14］。然而，gyrB基因在弧菌中具有較高的同源性，不同弧菌之間具有明顯遺傳距離，對于弧菌來說是一個很好的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。因此，基于gyrB基因的研究方法比16S rRNA基因測序方法更適用于弧菌種的鑒定，該方法具有特異性［15］。

目前，在國內(nèi)研究中對溶藻弧菌進(jìn)行Taqman-探針熒光定量PCR鑒定的報(bào)道較少。我們建立的基于gyrB基因的Taqman-探針熒光定量PCR鑒定溶藻弧菌的方法，通過對標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行靈敏度檢測發(fā)現(xiàn)該體系檢測的靈敏度為10-3mg/L，具有很好的檢測靈敏度。該體系在特異性檢測中標(biāo)準(zhǔn)株全陽性，其他6種病原菌全陰性，在區(qū)分溶藻弧菌與其他6種病原菌中具有較好的特異性，為臨床檢測溶藻弧菌提供了可靠的技術(shù)依據(jù)。

綜上所述，本研究建立的Taqman-探針熒光定量PCR技術(shù)在2 h內(nèi)可完成對溶藻弧菌的檢測工作。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、生化鑒定的方法相比，其檢測速度快、特異性和靈敏度高，適用于溶藻弧菌的快速檢測，具有應(yīng)用價(jià)值。但是本研究中特異性驗(yàn)證中其他菌株數(shù)較少，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)和驗(yàn)證。

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（本文編輯：李銀平）

Establishment of a method for the identification of Vibrio alginolyticus by Taqman-Probe fluorescencequantitative PCR analysis

Chen Changguo, Hou Bingbing, Chen Qiuyuan, Guo Jianwei, Zhao Qiangyuan. Department of Clinical Laboratory, Navy General Hospital PLA, 100048 Beijing, China

Objective To establish a method for the identification of Vibrio alginolyticus by Taqmanprobe fluorescence quantitative PCR analysis based on gyrB gene. Methods The standard strain of Vibrio algae-lysing (ATCC) and wild strains (WT) were studied as the research object, using the bio-software to design specific PCR primers and Taqman probe of Vibrio alginolyticus gyrB gene and detected by fluorescence quantitative PCR instrument. Results The detection sensitivity of gyrb gene of Vibrio alginolyticus by Taqman fluorescence quantitative PCR was 10-3mg/L. The detection method did not show positive amplification in detection of Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Saprophytic staphylococcus, Enterobacter hormaechei, Pseudomonas aeruginos, Escherichia coli 6 other common pathogenic bacteria. The specificity was 100%. Conclusions The fluorescence quantitative PCR method for the identification of Vibrio alginolyticus was successfully established. The method is specific and sensitive, it is suitable for rapid detection of Vibrio alginolyticus and has application value.

Taqman fluorescence probe; Fluorescence quantitative PCR; Vibrio alginolyticus; gyrB gene

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81401311）；軍隊(duì)后勤科研重點(diǎn)項(xiàng)目（BHJ14J005）；首都臨床特色應(yīng)用研究（吳階平專項(xiàng)：Z141107006614009）

100048 北京，中國人民解放軍海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科

陳昌國，Email：1234_chen@sina.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.01.001

2017-01-18）