劉海蓉，黃繼英，周征，胡薏冰，李永生，3，鄒鵬，戴瑤，3

(1.湖南大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410082； 2.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長沙 410082；3.噴射沉積技術(shù)及應(yīng)用湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082； 4.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013)

?

透明質(zhì)酸改性PHBV組織工程納米纖維支架的研究*

劉海蓉1，3?，黃繼英1，周征2，胡薏冰4，李永生1，3，鄒鵬1，戴瑤1，3

(1.湖南大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410082； 2.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長沙 410082；3.噴射沉積技術(shù)及應(yīng)用湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082； 4.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013)

組織工程支架材料表面性質(zhì)對細(xì)胞的黏附起著重要作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化等一系列生長過程.本研究采用天然生物大分子透明質(zhì)酸(hyaluronic acid ，HA)對聚(3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯)(Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，PHBV)進(jìn)行表面修飾以提高材料的表面生物活性.首先通過靜電紡絲法制備PHBV納米纖維支架，利用1,6-己二胺胺解在PHBV表面引入自由胺基，并以此為反應(yīng)活性位點在水溶性的碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺縮合劑體系中將透明質(zhì)酸固定接枝在PHBV表面.SEM結(jié)果表明，靜電紡絲制備的PHBV納米纖維支架表面平滑程度高，纖維直徑分布較均勻，且沒有串珠；FTIR證明1，6-己二胺改性及透明質(zhì)酸接枝改性PHBV納米纖維支架材料均成功實現(xiàn)；茚三酮法表明PHBV表面胺基密度隨胺解時間增加而增大，在胺解約50 min時達(dá)到最大值；水接觸角法表明固定接枝透明質(zhì)酸后，表面親水性明顯改善；細(xì)胞實驗表明透明質(zhì)酸改性的PHBV納米纖維支架可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的體外增殖.綜上所述，透明質(zhì)酸改性的PHBV納米纖維支架可望應(yīng)用于軟骨組織工程領(lǐng)域.

透明質(zhì)酸；PHBV納米纖維支架；表面改性；親水性；生物相容性

聚(3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯)(PHBV)是原核微生物合成的天然高分子共聚物，在生物體內(nèi)可以完全降解，最終產(chǎn)物為二氧化碳和水，具有良好的生物相容性、生物可降解性、熱穩(wěn)定性和力學(xué)性能，因此作為支架材料廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[1-3].然而，PHBV親水性較差，表面缺少細(xì)胞可識別的反應(yīng)位點，嚴(yán)重影響了細(xì)胞的黏附、生長和增殖[4-5].材料表面修飾是提高材料對細(xì)胞親和性的有效方法[6-8].WANG等[9]將膠原固定接枝在PHBV膜表面，以改善PHBV表面親水性，實驗結(jié)果表明固定膠原分子后，材料親水性明顯改善，通過培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，改性的PHBV膜材料能明顯促進(jìn)干細(xì)胞的黏附、遷移和增殖.Yu等[10]通過將殼聚糖和硫酸軟骨素共價固定在PHBV膜表面，發(fā)現(xiàn)改性后的PHBV生物材料親水性和生物相容性明顯改善，在材料上培養(yǎng)成纖維細(xì)胞結(jié)果表明，細(xì)胞在改性的PHBV膜上增殖活性大大提高.

透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，是重要的生理活性物質(zhì)，具有良好的生物相容性和特殊的生理功能，其不具抗原性、不致敏、不發(fā)生免疫反應(yīng)，并且能被生物體內(nèi)的透明質(zhì)酸酶降解，代謝過程本身在生物體中天然存在，不會產(chǎn)生任何有害的代謝產(chǎn)物[11-13].更為重要的是，透明質(zhì)酸能夠被特定的細(xì)胞受體識別，從而調(diào)控細(xì)胞的黏附、生長和分化等一系列生理行為[14-16].納米纖維支架材料由于具有較高的比表面積，很好地模擬了細(xì)胞在體內(nèi)的納米/次微米級別的膠原纖維束結(jié)構(gòu)，從而在組織工程領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用[17-18].靜電紡絲技術(shù)能夠連續(xù)制備納米級或次微米級超細(xì)纖維，其制備的支架具有獨特的微觀結(jié)構(gòu)和適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能，可以模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[19-20].本文采用靜電紡絲法制備了PHBV納米纖維支架，并且在充分了解PHBV酯基聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)特點的基礎(chǔ)上，采用二元胺解酯基法[21-22]在PHBV材料表面引入自由胺基，進(jìn)而以自由胺基為反應(yīng)活性位點，將透明質(zhì)酸生物大分子固定接枝在PHBV靜電紡絲納米纖維支架上，通過在改性納米纖維支架材料上種植羊關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞檢測改性支架材料的細(xì)胞親和性，以此評估改性PHBV納米纖維支架在軟骨組織工程中的應(yīng)用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

PHBV(Mw=300 000，3%HV)，寧波天安生物材料有限公司，結(jié)構(gòu)式見圖1(a)；透明質(zhì)酸，分析純，北京索萊寶科技有限公司，結(jié)構(gòu)式見圖1(b)；N，N-二甲基甲酰胺，1，6-己二胺，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿(CHCl3)，分析純，衡陽市凱信化工試劑有限公司；異丙醇，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；茚三酮，分析純，上海山浦化工有限公司；無水乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；碳化二亞胺(EDAC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；DMEM/HIGH GLUCOS培養(yǎng)基，胎牛血清，Gibco；雙抗(青霉素和鏈霉素)，胰蛋白酶，酶標(biāo)板，北京鼎國生物技術(shù)有限公司；AlamarBlue，Invitrogen；細(xì)胞培養(yǎng)皿，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Greiner bio-one.

圖1 PHBV(a)和透明質(zhì)酸(b)的分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of PHBV (a)and hyaluronic acid (b)

電子天平，F(xiàn)A1104，上海天平儀器廠；超聲波清洗機(jī)，EQ5200，昆山市超聲儀器有限公司；萬能倒置顯微鏡，IX2-1LL100，OLYMPUS；冷凍離心機(jī)，MICRO 17R,Thermo；單推注射泵，LSP01-1A，保定蘭格恒流泵有限公司；紫外可見分光光度計，UV-2600，Unico；傅里葉紅外光譜儀，Nexus，Thermo Nicolet；機(jī)械分析儀(TMA)，SS7300，日本精工；視頻光學(xué)水接觸角測量儀，DSA100，德國KRUSS公司；酶標(biāo)儀，MK3，Thermo；環(huán)境掃描電子顯微鏡，Quata200，USA；生物安全柜，HF-1200，中國力新發(fā)展有限公司；CO2培養(yǎng)箱，BB15，Thermo.

1.2 實驗過程

1.2.1 PHBV靜電紡絲納米纖維支架的制備

將PHBV粉末以5%(w/v)比例加入氯仿溶液，在60 ℃超聲溶解10 min，然后加入10%(v/v)N,N-二甲基甲酰胺，將制得的PHBV溶液轉(zhuǎn)移到玻璃注射器，置于注射泵機(jī)上.注射泵機(jī)上設(shè)置聚合物溶液流速為3.5 mL/h，注射器針頭到接收板距離為15 cm，靜電場電壓為15 kV.在電場力作用下，聚合物溶液克服表面張力噴射出去，形成細(xì)流，隨著溶劑揮發(fā)，形成纖維聚集在接收板上，從而得到PHBV納米纖維支架.制備好的PHBV納米纖維支架置于空氣中24 h，使殘余的氯仿溶劑揮發(fā)完全.

1.2.2 PHBV納米纖維支架表面引入自由胺基

二元胺中的一個胺基與含酯基聚合物材料上的酯基在一定條件下可以發(fā)生胺解反應(yīng)生成酰胺鍵，同時保留另一胺基的活性，這些自由胺基的存在不僅能提高聚酯類材料的親水性，中和此類聚合物在降解過程中產(chǎn)生的局部酸性，而且自由胺基所帶來的正電性還能促進(jìn)細(xì)胞與材料的黏附和鋪展，從而為細(xì)胞的生長提供一個友好的界面；另一方面，材料表面自由胺基的存在還提供了使聚合物進(jìn)一步與其它生物分子反應(yīng)的活性位點，胺解反應(yīng)過程見圖2.

將靜電紡絲制得的PHBV納米纖維支架裁成直徑為14 mm，厚度為1 mm的圓柱形樣品，將這些樣品浸入乙醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡30 min，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì).用水充分漂洗后，浸入1,6-己二胺/異丙醇溶液中，40 ℃下反應(yīng)一定時間，反應(yīng)完畢，用雙重蒸餾水將樣品沖洗三遍，然后將樣品浸沒于大量雙重蒸餾水中漂洗24 h，期間每隔4 h 換一次雙重蒸餾水，以除去表面未反應(yīng)的己二胺，然后放入30 ℃干燥箱中干燥，即可得到引入自由胺基的PHBV納米纖維支架(PHBV-NH2).

圖2 1,6-己二胺及透明質(zhì)酸改性PHBV流程圖Fig. 2 Schematic synthesis of 1，6-hexanediamine and hyaluronic acid modified PHBV

1.2.3 胺解PHBV納米纖維支架表面固定接枝透明質(zhì)酸

為進(jìn)一步提高材料的親水性和表面活性，在引入了自由胺基的條件下將透明質(zhì)酸固定在PHBV納米纖維支架表面.準(zhǔn)確量取45 mL雙重蒸餾水于50 mL離心管中，分別加入5 mg/mL透明質(zhì)酸、6 mg/mL EDAC，8 mg/mL NHS，制成透明質(zhì)酸活化體系溶液，4 ℃條件下活化36 h后，取出活化溶液，分成15 mL各三份，加入1,6-己二胺胺解的PHBV納米纖維支架，室溫下反應(yīng)36 h.用大量雙重蒸餾水洗凈透明質(zhì)酸改性的PHBV納米纖維表面的EDAC/NHS溶液，常溫下烘干，得到胺解40 min，60 min,80 min接枝HA的PHBV納米纖維支架，為便于區(qū)分，分別命名為PHBV-H1，PHBV-H2，PHBV-H3，反應(yīng)流程圖如圖2所示.

1.2.4 軟骨細(xì)胞與改性PHBV納米纖維支架材料共培養(yǎng)

在材料上培養(yǎng)軟骨細(xì)胞前需要對材料進(jìn)行預(yù)處理，主要是指對材料進(jìn)行滅菌消毒防止外界帶入細(xì)菌影響細(xì)胞的生長，以及進(jìn)行培養(yǎng)液的預(yù)浸泡平衡細(xì)胞的生存環(huán)境.將經(jīng)75%乙醇充分滅菌的PHBV及改性PHBV納米纖維支架放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入適量新鮮培養(yǎng)液預(yù)浸泡，在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置24 h.取出經(jīng)過預(yù)浸泡的納米纖維支架材料，除去浸泡液后備用.當(dāng)軟骨細(xì)胞長滿整個培養(yǎng)皿時，用胰蛋白酶消化使細(xì)胞脫壁后及時加入適量新鮮培養(yǎng)液終止消化，吹打均勻制成細(xì)胞懸浮液.利用血細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)接種數(shù)量稀釋成相應(yīng)的濃度后，將適量細(xì)胞懸浮液滴加到材料中(每個材料試樣接種1×104個細(xì)胞)，將其放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4～6 h，使細(xì)胞黏附在材料上后，再將含有細(xì)胞的材料轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板上，加入適量的新鮮培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).

2 結(jié)果與討論

2.1 PHBV納米纖維支架表面形貌

PHBV納米纖維支架和透明質(zhì)酸改性的PHBV納米纖維支架的形貌如圖3所示.從圖中可觀察到納米纖維支架材料是由不同取向的纖維堆積形成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維孔隙相互貫通，纖維表面平滑程度高，樣品纖維直徑分布較均勻，且沒有串珠.選取五張圖片，用Image J軟件量取100根纖維，得到纖維直徑大小分布圖(圖3(c)(d)).測量統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHBV納米纖維的平均直徑為723 ± 38 nm，改性的PHBV納米纖維平均直徑為756 ± 68 nm.從數(shù)據(jù)結(jié)果看，改性的PHBV納米纖維直徑略有增加，這是因為透明質(zhì)酸大分子固定接枝在PHBV表面，隨機(jī)占領(lǐng)了PHBV納米纖維表面一定空間，從而使纖維直徑略微增大，但在統(tǒng)計學(xué)分析上，與PHBV納米纖維直徑大小無顯著差異，說明接枝透明質(zhì)酸分子并沒有影響PHBV納米纖維的形貌.

2.2 茚三酮法測定PHBV材料表面胺基密度

為檢測材料表面胺基密度隨反應(yīng)時間的變化，本研究采用茚三酮法定量分析胺解材料表面的胺基密度.將胺解納米纖維支架在茚三酮/乙醇溶液中浸泡1 min，然后直接放入潔凈試管中，在80 ℃水浴中加熱15 min，以加速胺基與茚三酮的反應(yīng).待材料表面呈現(xiàn)藍(lán)紫色時往試管中加3 mL氯仿以溶解此材料，另加3 mL異丙醇以穩(wěn)定反應(yīng)所產(chǎn)生的藍(lán)紫色，然后在紫外-可見分光光度計上測吸光度，所測吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，即可得到納米纖維支架材料表面的胺基密度.

圖3 PHBV纖維(a)(c)和HA改性的PHBV纖維(b)(d)的電鏡圖及纖維直徑分布圖 (p>0.05)Fig. 3 SEM images and fiber diameter distribution of PHBV fibers (a)(c)and HA modified PHBV fibers (b)(d)，respectively (p>0.05)

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將己知濃度的1,6-己二胺溶液(以異丙醇∶氯仿=1∶1作溶劑)用茚三酮顯色反應(yīng)后，使用多波長紫外分光光度計在1,6-己二胺最大吸收峰位置563 nm下測試其吸光度.以吸光度對1,6-己二胺溶液官能團(tuán)胺基(-NH2)的摩爾濃度作圖，即可得到1,6-己二胺胺基(-NH2)摩爾濃度與吸光度對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4(a)所示.

在10%(w/v)1,6-己二胺/異丙醇濃度下，表面胺基密度隨胺解反應(yīng)時間的變化曲線如圖4(b)所示.由圖可知，表面胺基密度先是隨胺解反應(yīng)時間的增加而增大，在約50 min時達(dá)到最大值，而后有所下降.這是由于胺解在本質(zhì)上會導(dǎo)致表層聚合物的部分降解，因此，當(dāng)胺解達(dá)到一定程度時，必將導(dǎo)致聚合物表層的溶解或脫落，造成胺基密度下降.此外，長時間的胺解將導(dǎo)致聚合物材料機(jī)械性能的下降甚至材料的整體崩解，在胺解反應(yīng)時間超過80 min時，材料發(fā)生明顯脆化，因此制樣時胺解時間均不超過80 min.

圖4 胺基與茚三酮反應(yīng)物的紫外可見光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線和胺解的PHBV表面胺基密度隨胺解時間的變化曲線Fig. 4 The calibration curve of UV-vis absorbance of ninhydrin-NH2 compound at 563 nm (a)and the NH2 group density on the aminolyzed PHBV surface as a function of aminolysis time (b)

2.3 FTIR化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

通過傅里葉變換紅外光譜儀分別對PHBV樣品、1,6-己二胺改性PHBV樣品和透明質(zhì)酸改性的PHBV樣品粉末進(jìn)行紅外分析，結(jié)果如圖5所示.從FTIR分析譜圖上可以看出，對于PHBV分子，紅外譜圖中的1 725 cm-1為PHBV中典型的羰基酯(C=O)伸縮振動峰，2 985 cm-1，2 925 cm-1，2 890 cm-1分別為-CH3，-CH2，-CH的反對稱伸縮振動峰.相比于未改性的PHBV樣品，1,6-己二胺改性的PHBV在1 725 cm-1處的吸收峰減弱，這是由于1,6-己二胺與PHBV主鏈上的酯基鍵發(fā)生胺解反應(yīng)，使得酯基鍵數(shù)量減小.而在3 441 cm-1處出現(xiàn)的新吸收峰，對應(yīng)的是胺基上N—H的伸縮振動，1 460 cm-1處對應(yīng)的是生成的C—N鍵的伸縮振動.對于透明質(zhì)酸改性的PHBV紅外譜圖，在3 700～3 500 cm-1波段出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰，這對應(yīng)的是透明質(zhì)酸上自由羥基和羧基的O—H鍵伸縮振動吸收峰，另外，在3 400～2 800 cm-1波段出現(xiàn)寬且強(qiáng)的吸收峰，這對應(yīng)的是透明質(zhì)酸酰胺鍵的N—H伸縮振動，而在1 288 cm-1處的吸收峰相較于1,6-己二胺改性的PHBV有所減弱，這是透明質(zhì)酸接枝改性發(fā)生酰胺化反應(yīng)，消耗了PHBV表面引入的部分胺基所致.這些結(jié)果表明，1,6-己二胺改性及透明質(zhì)酸改性PHBV纖維支架均成功實現(xiàn).

圖5 HA接枝改性PHBV的紅外光譜對比圖：PHBV (a)，1，6-己二胺改性PHBV (b)，HA改性PHBV (c)Fig. 5 FTIR spectra of PHBV (a)，1，6-hexanediamine modified PHBV (b)and hyaluronic acid modified PHBV (c)

2.4 表面親水性檢測

細(xì)胞直接也是最先接觸并發(fā)生作用的是材料表面，因此，提高材料表面的親水性對促進(jìn)細(xì)胞的黏附至關(guān)重要[23-24].一般來講，材料親水性好時，與水的親和力強(qiáng)，易被水潤濕，其水接觸角相應(yīng)會比較小，反之，水接觸角會比較大.本研究采用DSA100型號視頻光學(xué)水接觸角測量儀對材料的親水性接觸角進(jìn)行測量.圖6(a)是1,6-己二胺改性及透明質(zhì)酸改性PHBV材料表面的水接觸角隨胺解反應(yīng)時間的變化曲線.由圖可知，經(jīng)過胺解反應(yīng)后，PHBV表面引入了一定量的親水性基團(tuán)胺基，胺解改性樣品(PHBV-NH2)的水接觸角隨胺解時間的增加而減小，但減小幅度較小，這可能是因為親水性的胺基在疏水的空氣中不易伸展，而且為了降低分子表面能，可能會隱藏在疏水的分子鏈中，因此在測接觸角時，胺基的親水性并未能完全體現(xiàn)出來.此外，胺解的PHBV樣品表面水接觸角并不與表面胺基密度成比例關(guān)系，胺解時間超過50 min的PHBV-NH2材料親水性比所測胺基密度最大的50 min胺解時間的材料要好，這是因為接觸角除了與表面親水基團(tuán)有關(guān)，也與材料表面形貌有關(guān)，胺解時間越長，PHBV材料表層聚合物分解得越多，材料表面變粗糙，從而使水接觸角減小.

圖6 不同改性PHBV樣品表面水接觸角隨胺解時間的變化曲線和透明質(zhì)酸改性 PHBV的表面水滴接觸圖(1,6-己二胺濃度為10%(w/v))Fig. 6 The influence of aminolysis time on the water contact angle of treated PHBV fibrous scaffolds and the images of water drop on PHBV (a)，PHBV-H1 (b)，PHBV-H2 (c)，PHBV-H3 (d)at 10%(w/v)1,6-hexanediamine concentration，respectively

由胺基密度測定結(jié)果可知(圖4(b))，胺解時間在40～80 min之間的PHBV表面胺基密度較大，且為保證樣品之間的差異性，本實驗采用胺解40 min，60 min，80 min的PHBV納米纖維支架固定接枝透明質(zhì)酸大分子，為方便區(qū)分，分別命名為PHBV-H1，PHBV-H2，PHBV-H3，進(jìn)而研究不同接枝率梯度的透明質(zhì)酸改性PHBV納米纖維支架對軟骨細(xì)胞體外增殖的效果.圖6(b)是透明質(zhì)酸改性的PHBV納米纖維支架材料的水接觸角照片，由圖可以看出，PHBV材料具有高分子的疏水特性，其水接觸角比較大，約為122°，親水性較差；隨著胺解時間的增加，材料與水的潤濕性提高，表現(xiàn)為水滴在膜材料上更加容易鋪展開.固定接枝透明質(zhì)酸后，改性的PHBV納米纖維支架的水接觸角分別下降到了109°，101°和 93°，親水性明顯改善，并且接枝了透明質(zhì)酸的PHBV納米纖維支架材料的親水性也明顯優(yōu)于1，6-己二胺改性的PHBV納米纖維支架材料(圖6(a))，這主要是由于生物活性大分子透明質(zhì)酸具有優(yōu)良的親水性，固定接枝至PHBV高分子主鏈上后可以增加對水的吸附能力，改善高分子基體的親水性.

2.5 細(xì)胞在材料上的生長形貌

軟骨細(xì)胞與支架材料接觸后通常要經(jīng)歷黏附、遷移和增殖等幾個階段，其中黏附是細(xì)胞與材料相互作用的第一個階段[25-26].圖7為軟骨細(xì)胞在HA改性的PHBV納米纖維支架材料上培養(yǎng)1 d和7 d的電鏡圖片，由圖7(a)～(d)可知，細(xì)胞在PHBV納米纖維支架材料上黏附良好，呈多邊形鋪展生長，且逐漸生出偽足與材料表面緊密的貼合在一起.這可能是由于靜電紡絲納米纖維支架可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)天然的納米級纖維束結(jié)構(gòu)，因此有利于細(xì)胞的黏附行為.

培養(yǎng)至第七天，由圖7(e)～(f)可觀察到，軟骨細(xì)胞在HA改性的PHBV納米纖維支架材料表面形態(tài)正常，伸出扁狀偽足相互連接或黏附在材料表面，同時分泌出許多細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)覆蓋在細(xì)胞周圍的纖維支架材料上，細(xì)胞間緊密生長；PHBV納米纖維支架材料上細(xì)胞分泌的ECM數(shù)量相對較少(圖7(e)).此外由圖7(e)～(f)可看到，在軟骨細(xì)胞生長的周圍出現(xiàn)纖維拉斷的現(xiàn)象，這可能是由于軟骨細(xì)胞與紡絲纖維黏附力強(qiáng)，隨著細(xì)胞活動舒展，細(xì)胞間黏附的纖維發(fā)生扯斷.以上實驗結(jié)果表明，采用天然生物大分子透明質(zhì)酸改性PHBV納米纖維支架，可以改善PHBV基體的表面性質(zhì)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而可促使軟骨細(xì)胞在改性的PHBV納米纖維支架材料上的增殖.

圖7 軟骨細(xì)胞在HA改性的PHBV納米纖維支架上培養(yǎng)1天和7天的SEM圖，PHBV (a)(e)， PHBV-H1 (b)(f)，PHBV-H2 (c)(g) and PHBV-H3 (d)(h)Fig.7 SEM micrographs of chondrocytes cultured on PHBV (a)(e)，PHBV-H1 (b)(f)， PHBV-H2 (c)(g)and PHBV-H3 (d)(h)for 1d and 7d，respectively

2.6 Alamar Blue法檢測軟骨細(xì)胞的增殖活性

為定量表征軟骨細(xì)胞在透明質(zhì)酸改性的PHBV納米纖維支架上的增殖活性，本研究采用特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的Alamar Blue手段檢測軟骨細(xì)胞在支架上的增殖率[27-29].圖8為軟骨細(xì)胞在不同胺解時間的透明質(zhì)酸改性PHBV納米纖維支架的Alamar Blue檢測結(jié)果.由圖可知，細(xì)胞培養(yǎng)至第七天，與純PHBV納米纖維支架5.4倍的增殖率相比，PHBV-H1，PHBV-H2和PHBV-H3分別達(dá)到了6.6倍、7.6倍、6.1倍，增殖率有明顯提高.其中PHBV-H2纖維支架對軟骨細(xì)胞體外增殖的促進(jìn)作用最為顯著，在一周的細(xì)胞培養(yǎng)過程中基本保持指數(shù)式增長，這說明透明質(zhì)酸作為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，對調(diào)控軟骨細(xì)胞的黏附、生長及增殖起著重要的作用.實驗結(jié)果表明，在PHBV材料表面引入透明質(zhì)酸生物大分子，可以明顯改善材料的生物相容性，提高細(xì)胞的增殖活性.

3 結(jié) 論

本文以天然可降解的PHBV作為高分子基體，采用靜電紡絲法制備PHBV納米纖維支架，利用1,6-己二胺反應(yīng)引入自由胺基，并以此為反應(yīng)位點，在PHBV納米纖維支架材料表面固定接枝天然生物大分子透明質(zhì)酸，以提高PHBV納米纖維支架表面親水性并提供細(xì)胞可識別的黏附位點，從而提高軟骨細(xì)胞在納米纖維支架材料上的增殖活性.FTIR檢測表明1,6-己二胺改性及透明質(zhì)酸固定接枝改性PHBV材料均成功實現(xiàn).茚三酮法定量測定材料表面胺基密度結(jié)果表明，在胺解時間達(dá)到50 min時，表面胺基密度最大.SEM圖片表明靜電紡絲法制備的PHBV納米纖維直徑分布較均勻，纖維表面平滑程度高，且沒有串珠，纖維堆積形成的孔隙相互貫通.水接觸角測量結(jié)果表明，PHBV材料表面親水性隨胺解時間增加而提高，固定接枝透明質(zhì)酸生物分子后，PHBV材料的水接觸角從改性前的122°分別下降到了109°，101°和93°，材料親水性明顯改善.體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，在PHBV材料表面引入透明質(zhì)酸生物大分子，可以改善PHBV基體的表面性能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞黏附生長并分泌許多細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而提高細(xì)胞在PHBV納米纖維支架材料上的增殖活性.

[1] ZHOU M，YU D. Cartilage tissue engineering using PHBV and PHBV/Bioglass scaffolds [J]. Molecular Medicine Reports，2014，10(1)：508-514.

[2] SUN J，WU J，LI H，etal. Macroporous poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)matrices for cartilage tissue engineering [J]. European Polymer Journal，2005，41(10)：2443-2449.

[3] K?SE G T，KORKUSUZ F，KORKUSUZ P，etal. Bone generation on PHBV matrices：an in vitro study [J]. Biomaterials，2003，24(27)：4999-5007.

[4] WANG Y J，WEI H，LI R，etal. Fabrication and characterization of a PAM modified PHBV/BG scaffold [J]. Chinese Science Bulletin，2009，54(17)：2940-2946.

[5] KESHEL S H，BIAZAR E，REZAEI T M，etal. The healing effect of unrestricted somatic stem cells loaded in collagen-modified nanofibrous PHBV scaffold on full-thickness skin defects [J]. Artificial Cells Blood Substitutes & Biotechnology，2014，42(3)：210-216.

[6] SOUSA I，MENDES A，PEREIRA R F，etal. Collagen surface modified poly(ε-caprolactone)scaffolds with improved hydrophilicity and cell adhesion properties [J]. Materials Letters，2014，134：263-267.

[7] LAO L，TAN H，WANG Y，etal. Chitosan modified poly(L-lactide)microspheres as cell microcarriers for cartilage tissue engineering [J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces，2008，66(2)：218-225.

[8] ZHU Y，GAO C，HE T，etal. Layer-by-layer assembly to modify poly(l-lactic acid)surface toward improving its cytocompatibility to human endothelial cells [J]. Biomacromolecules，2003，4(2)：446-452.

[9] WANG L Y，WANG Y J，CAO D R. Surface modification of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)membrane by combining surface aminolysis treatment with collagen immobilization [J]. Journal of Macromolecular Science，Part A，2009，46(8)：765-773.

[10]YU D G，LIN W C，LIN C H，etal. Cytocompatibility and antibacterial activity of a PHBV membrane with surface-immobilized water-soluble chitosan and chondroitin-6-sulfate [J]. Macromolecular Bioscience，2006，6(5)：348-357.

[11]BURDICK J A，PRESTWICH G D. Hyaluronic acid hydrogels for biomedical applications [J]. Advanced Materials，2011，23(12)：41-56.

[12]YUAN J，GHOSH K，XIAO Z S，etal. Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds [J]. Biomaterials，2006，27(20)：3782-3792.

[13]GOA K L，BENFIELD P. Hyaluronic acid. A review of its pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology，and its therapeutic potential in joint disease and wound healing [J]. Drugs，1994，47(3)：536-566.

[14]CHUAP H，NEOH K G，KANG E T，etal. Surface functionalization of titanium with hyaluronic acid/chitosan polyelectrolyte multilayers and RGD for promoting osteoblast functions and inhibiting bacterial adhesion [J]. Biomaterials，2008，29(10)：1412-1421.

[15]YAMANE S，IWASAKI N，MAJIMA T，etal. Feasibility of chitosan-based hyaluronic acid hybrid biomaterial for a novel scaffold in cartilage tissue engineering [J]. Biomaterials，2005，26(6)：611-619.

[16]YOO H S，LEE E A，YOON J J，etal. Hyaluronic acid modified biodegradable scaffolds for cartilage tissue engineering [J]. Biomaterials，2005，26(14)：1925-1933.

[17]MA P X，LANGER R. Fabrication of biodegradable polymer foams for cell transplantation and tissue engineering [J]. Methods in Molecular Medicine，1999，18：47-56.

[18]PALECEK S P，LOFTUS J C，GINBERG M H，etal. Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness [J]. Nature，1997，385(6616)：537-540.

[19]LU L X，WANG Y Y，MAO X，etal. The effects of PHBV electrospun fibers with different diameters and orientations on growth behavior of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells [J]. Biomedical Materials，2012，7(1)：1948-1958.

[20]TONELLO P R C，CARACCIOLO P C，CUADRADO T R，etal. Structural characterization of electrospun micro/nanofibrous scaffolds by liquid extrusion porosimetry：A comparison with other techniques [J]. Materials Science & Engineering C，2014，41：335-342.

[21]XIA Z，LU Z，VALTCHEV P，etal. Surface modification of poly(propylene carbonate)by aminolysis and layer-by-layer assembly for enhanced cytocompatibility [J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces，2012，93(1)：75-84.

[22]BAKARE R A，BHAN C，RAGHAVAN D. Synthesis and characterization of collagen grafted poly(hydroxybutyrate-valerate)(PHBV)scaffold for loading of bovine serum albumin capped silver (Ag/BSA)nanoparticles in the potential use of tissue engineering application [J]. Biomacromolecules，2014，15(1)：423-435.

[23]CUI W，CHENG L，LI H，etal. Preparation of hydrophilic poly(l-lactide)electrospun fibrous scaffolds modified with chitosan for enhanced cell biocompatibility [J]. Polymer，2012，53(11)：2298-2305.

[24]田冶，王迎軍，周長忍,等. 成骨細(xì)胞在表面酰胺化聚乳酸膜上的黏附和增殖行為[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2009，30(12)：2491-2495.

TIAN Ye，WANG Yingjun，ZHOU Changren，etal. Adhesion and proliferation of osteoblasts on the surface of the amide poly(lactic acid)membrane [J]. Chemical Jounal of Chinese Universities，2009，30(12)：2491-2495.(In Chinese)

[25]BHARDWAJ G，WEBSTER T J. Enhanced chondrocyte culture and growth on biologically inspired nanofibrous cell culture dishes [J]. International Journal of Nanomedicine，2016，11(1):479.

[26]JONNALAGADDA J B，RIVERO I V，DERTIEN J S. In vitro chondrocyte behavior on porous biodegradable Poly (e-caprolactone)/poly glycolic acid scaffolds for articular chondrocyte adhesion and proliferation [J]. Journal of Biomaterials Science Polymer Edition，2015，26(7)：401-419.

[27]楊陽，劉寶瑞，錢曉萍. Alamar Blue法用于體外培養(yǎng)細(xì)胞活性檢測的方法研究[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2006，14(1)：6-8.

YANG Yang，LIU Baorui，QIAN Xiaoping. Study on the method of Alamar Blue assay for cell activity detection in vitro [J]. Journal of Modern Oncology，2006，14(1)：6-8.(In Chinese)

[28]WANG N，ZHOU Z，XIA L，etal. Fabrication and characterization of bioactive beta-Ca2SiO4/PHBV composite scaffolds [J]. Materials Science & Engineering C:Materials for Biological Applications，2013，33(4)：2294-2301.

[29]LIU H，XIA L，DAI Y，etal. Fabrication and characterization of novel hydroxyapatite/porous carbon composite scaffolds [J]. Materials Letters，2012，66(1)：36-38.

Surface Modification of PHBV Tissue Engineering NanofibrousScaffolds with Hyaluronic Acid

LIU Hairong1，3?，HUANG Jiying1，ZHOU Zheng2，HU Yibing4，LI Yongsheng1，3，ZOU Peng1，DAI Yao1，3

(1.College of Materials Science and Engineering，Hunan University，Changsha 410082，China;2.College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China;3.Hunan Province Key Laboratory for Spray Deposition Technology and Application，Hunan University，Changsha 410082，China;4.Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410013，China)

Surface properties of tissue engineering scaffold play important roles in cell adhesion and other biological processes such as cell proliferation,differentiation. In this study,the surface modification of Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) was performed in order to improve the biological activity of material surface. PHBV nanofibrous scaffold was firstly made by electrostatic spinning method,introducing free amino groups in the PHBV surface through 1,6-hexanediamine,which provided reaction sites for the further immobilization of hyaluronic acid (HA) macromolecules. The morphology observed by SEM showed that PHBV nanofibrous scaffolds prepared by electrostatic spinning method have smooth surfaces without obvious beads defects and their fiber diameters uniformly distribute. FTIR analysis proved that 1,6-hexanediamine and hyaluronic acid modified PHBV fibrous scaffolds were successfully achieved. The ninhydrin determination results showed that the surface amine group density,which increased with the extending of aminolysis time,reached its maximum at 50 minutes. Furthermore,there is no significant difference on the morphology of the scaffolds before and after modification by statistic comparison. The water contact angle significantly decreased after the immobilization of hyaluronic acid,indicating that the hydrophilicity was obviously improved after surface modification with the hydrophilic natural biological macromolecules. The Alamar Blue assay manifested that hyaluronic acid modified PHBV nanofibrous scaffolds could significantly promote the chondrocytes proliferationinvitro. Therefore,the hyaluronic acid modified PHBV nanofibrous scaffolds are potential for application in cartilage tissue engineering.

hyaluronic acid;PHBV nanofibrous scaffolds;surface modification;hydrophilicity;biocompatibility

1674-2974(2017)06-0087-09

10.16339/j.cnki.hdxbzkb.2017.06.015

2016-08-11

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才(NECT-12-0170)；湖南省自然科學(xué)基金(2016JJ2023)，Natural Science Foundation of Hunan Province(2016JJ2023)；湖南省研究生創(chuàng)新基地(2014-2017)；湖南大學(xué)交叉學(xué)科研究資助項目(2014JCA09)

劉海蓉(1971-)，女，湖南衡陽人，湖南大學(xué)副教授，博士?通訊聯(lián)系人，E-mail：liuhairong@hnu.edu.cn

O632；O636

A