董 震，汪中明，張洪清，張 濤，伍 祎，江亞杰，章 妺，林麗莎，曹 陽*

（1．河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2．國家糧食局科學研究院，北京 100037；3．福建省糧油科學技術(shù)研究所，福建 福州 350001）

赤擬谷盜對4種小麥揮發(fā)物的觸角電位及行為反應

董 震1，汪中明2，張洪清2，張 濤2，伍 祎2，江亞杰1，章 妺2，林麗莎3，曹 陽2*

（1．河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2．國家糧食局科學研究院，北京 100037；3．福建省糧油科學技術(shù)研究所，福建 福州 350001）

擬通過觸角電位技術(shù)（EAG）技術(shù)探索利用化學信息物質(zhì)監(jiān)測防治赤擬谷盜的方法。探索了赤擬谷盜EAG測量過程中的基本操作方法，揭示了其離體觸角EAG反應的適應性和持續(xù)時間；利用EAG技術(shù)和四臂嗅覺儀檢測了赤擬谷盜對4種不同濃度小麥揮發(fā)物的觸角電位及行為反應。結(jié)果表明：EAG測量過程中兩次刺激的最小間隔為60 s；30 min內(nèi)EAG值變化幅度約為5%；在一定濃度范圍內(nèi)，赤擬谷盜對4種小麥揮發(fā)物的EAG反應隨揮發(fā)物濃度的增加而增強，但水楊酸甲酯質(zhì)量濃度超過5 μg/μL后赤擬谷盜EAG值開始下降；行為反應測試中，苯甲醛表現(xiàn)出對赤擬谷盜有一定的引誘作用。EAG結(jié)果與行為反應有一定的相關性，但也存在區(qū)別。因此，要確定氣味物質(zhì)對昆蟲的活性，還需要到實際環(huán)境中進行試驗。

赤擬谷盜；小麥揮發(fā)物；EAG；行為反應

0 前言

赤擬谷盜（Tribolium castaneum Herbst）屬鞘翅目擬步甲科，是一種重要的世界儲糧害蟲，為害嚴重[1]。目前，赤擬谷盜防治仍然以PH3熏蒸為主[2]，對赤擬谷盜危害的監(jiān)測與綜合防治，應開展全方位的研究[3]。探索赤擬谷盜和化學信息物質(zhì)之間的相互作用關系是尋求防治方法的重要工作[4-5]。植物釋放的揮發(fā)性氣味與昆蟲的定位、取食、繁衍等生活行為息息相關[6-9]，觸角電位技術(shù)（EAG）是鑒別植物揮發(fā)性物質(zhì)對昆蟲有無作用的常用技術(shù)之一，通過觸角電位的有無和大小，可以判斷刺激物對昆蟲是否有活性和活性強弱，快速準確地篩選出活性物質(zhì)[10-12]。

農(nóng)業(yè)上應用EAG技術(shù)已發(fā)現(xiàn)了許多活性物質(zhì)，如測定小菜蛾時，六碳醛、青葉醇等能引起小菜蛾較高的觸角電位反應，在行為上也表現(xiàn)出對小菜蛾的吸引[13]。鞘翅目昆蟲對萜烯類物質(zhì)的觸角電位反應較強烈，如松褐天牛雄蟲對Carene的反應最為強烈[14]。此外，測量不同組合、配比及劑量的人工合成性信息素對棉鈴蟲雄蟲的觸角電位反應，對進一步改進棉鈴蟲性誘劑的田間應用具有指導意義[15]。

赤擬谷盜由于其觸角微?。ú坏? mm）且蟲體堅硬，限制了觸角電位技術(shù)在其中的應用。作者擬探索赤擬谷盜EAG測量過程中的基本操作方法及條件，揭示其離體觸角EAG反應的適應性和持續(xù)時間，為赤擬谷盜EAG的測量提供參考；利用EAG技術(shù)和四臂嗅覺儀檢測赤擬谷盜對4種不同濃度小麥揮發(fā)物的觸角電位及行為反應，對比分析觸角電位與行為反應的關系，為進一步揭示赤擬谷盜的嗅覺反應特點、探索信息物質(zhì)在赤擬谷盜監(jiān)測和綜合防治中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

赤擬谷盜試蟲由國家糧食局科學研究院提供，人工氣候室內(nèi)連續(xù)多代飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃，光照黑暗比為16∶8。選擇生長發(fā)育一致、羽化后34 d的健康成蟲進行觸角電位和行為測試。

1.2 儀器與設備

常規(guī)用具：移液槍、移液槍頭、小鑷子、毛筆、Kaisaling液、巴斯德管、玻璃毛細管、濾紙等。

觸角電位儀[16]：荷蘭Syntech公司，主要由5部分組成，即IDAC-4型四通道信號采集控制器、EAG數(shù)據(jù)記錄及分析軟件、PRG-2型探頭及電極固定器、CS-55型刺激氣流控制器、MP-22型顯微操作臺；防電磁干擾的法拉第籠：自制；QP-01型四臂嗅覺儀：點將（上海）科技股份有限公司。

1.3 標準化合物

選取4種小麥揮發(fā)物組分[17]：6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO），98%，Merck；順-3-己烯乙酸酯（HA），99%，沃凱；苯甲醛（BD），98%，AR（滬試）；水楊酸甲酯（MS），99%，Sigma。正己烷：98%，AR（京試）。

1.4 觸角電位反應測試

1.4.1 測試方法

首先將 20 μL揮發(fā)物溶液滴加在 20 mm×5 mm的濾紙片上，然后將濾紙嵌入巴斯德管中，密閉后置于冰箱中待用。操作過程中，將巴斯德管接氣流控制器，出口正對觸角并始終保持與觸角相同距離，由氣流控制器提供氣流，流量100 mL/s，刺激時間為0.4 s，由記錄儀記錄數(shù)據(jù)[18]。測試過程中，首先利用改造過的移液槍頭將參比電極插入赤擬谷盜頭部，玻璃電極內(nèi)充滿Kaisaling液，此時頭部及觸角離體；然后將觸角端部套在記錄電極中，觸角與記錄電極內(nèi)的Kaisaling液接觸，同時應保證觸角完全暴露在空氣中，尤其是末端膨大的3節(jié)，以保證觸角所有部位均可接受刺激物的刺激。測試時環(huán)境溫度保持在28℃。1.4.2 觸角EAG適應性測定

“無規(guī)矩不可成方圓”。黨中央的“八項規(guī)定”“三嚴三實”及“自律準則”“處分條例”等就是最好的規(guī)矩。千里之堤毀于蟻穴，一些巨貪，往往就是從貪小便宜步步為“盈”“煉”成的?！耙佐~”類似事件的嚴肅處理，體現(xiàn)的是“抓早抓小”，防微杜漸，以遏制由量變到質(zhì)變。“好規(guī)矩”需善始善終，嚴要求產(chǎn)生好成效，嚴管理養(yǎng)成好習慣，嚴標準才能得民心。杜絕“易魚”類似案例發(fā)生，打虎學武松拳頭要硬的同時，拍蠅力度亦不能松。

為了確定每兩次刺激的最佳間隔時間，用20 μL的苯甲醛作為標準刺激物，間隔時間分別為15、30、60 s，每次處理共刺激5次，重復3根觸角。每種間隔刺激的EAG反應結(jié)果用第一次的測定結(jié)果標準化[18]，即標準化的×100%。

1.4.3 觸角持續(xù)反應時間測定

為了明確赤擬谷盜觸角接受刺激的持續(xù)反應時間，用20 μL的苯甲醛作為標準刺激物，每間隔15 min刺激1次，共刺激8次，重復3根觸角。以第1次刺激獲得的EAG反應值標準化。比較2 h內(nèi)EAG反應的變化[18]。

1.4.4 劑量反應

為了明確赤擬谷盜觸角對不同濃度刺激物的劑量反應，對苯甲醛（BD）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）、水楊酸甲酯（MS）和順-3-己烯乙酸酯（HA）做劑量反應。揮發(fā)物質(zhì)量濃度分別為0.005、0.05、0.5、5、50 μg/μL。

1.5 行為反應測試

測定時調(diào)節(jié)氣流速度為370 mL/min,在此速度下四臂嗅覺儀的4個區(qū)域分界明顯[19]。四臂嗅覺儀進氣口連接帶有活性炭的圓底燒瓶，以得到純凈的空氣。選擇對角的兩個區(qū)作為處理區(qū)，剩下的兩個區(qū)域為對照區(qū)，以觸角電位反應中反應值最高的濃度作為每種反應物的測試濃度，在氣味源瓶內(nèi)加入20 μL該濃度待測信息氣味物質(zhì)。每種濃度樣品測試3次，每次測試30頭成蟲。測試5 min后，檢查各誘集瓶內(nèi)（或聯(lián)結(jié)管的進口孔）的測試昆蟲數(shù)量，計算誘集率。

2 結(jié)果與分析

2.1 觸角EAG適應性測定

赤擬谷盜離體觸角在15、30、60 s時間間隔下的EAG反應如圖1所示。從圖1可以看出，在15 s和30 s時間間隔下，其EAG反應值在第2次重復刺激時顯著下降，EAG值下降分別約為40%和20%，赤擬谷盜表現(xiàn)出了對苯甲醛的反應適應性。當時間間隔為60 s時，連續(xù)刺激5次的EAG反應值變化很小。因此，選定兩次刺激的最小時間間隔為60 s。

圖1 赤擬谷盜在3種時間間隔下的EAG反應Fig.1 Nomalized EAG response values of T.castaneum to BD at 3 different time intervals

2.2 觸角持續(xù)反應時間測定

利用赤擬谷盜離體觸角測定EAG，其EAG反應值在120 min內(nèi)的變化如圖 2所示?？傮w上看，120 min內(nèi)，EAG總體下降了約 50%。前30 min EAG值變化幅度較小，下降幅度約5%；30～60 min之間，EAG值下降幅度較大；60 min后，EAG值下降幅度較小，但 EAG值維持在較低水平。因此，每個赤擬谷盜離體觸角的聯(lián)系測量時間不應超過30 min，以保證獲得準確的測量值。

圖2 赤擬谷盜在120 min內(nèi)的EAG反應Fig.2 Nomalized EAG response values of T.castaneum within 120 min

2.3 劑量反應

赤擬谷盜對4種刺激物的劑量反應曲線如圖3所示。整體上看，在一定范圍內(nèi)，赤擬谷盜對4種刺激物的EAG值隨4種刺激物質(zhì)量濃度的增大而增大。當刺激物質(zhì)量濃度較小時，赤擬谷盜對4種刺激物的EAG值比較接近，隨著質(zhì)量濃度的增大，赤擬谷盜對不同種類的刺激物的EAG反應值出現(xiàn)了較大差別，隨苯甲醛（BD）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）、和順-3-己烯乙酸酯（HA）質(zhì)量濃度的升高，EAG始終保持上升的趨勢；而當水楊酸甲酯質(zhì)量濃度大于5 μg/μL時，EGA開始下降。

圖3 赤擬谷盜的劑量反應曲線Fig.3 EAG dose-dependent curve for T.castaneum

2.4 行為反應測試

利用四臂嗅覺儀測試赤擬谷盜對4種氣味物質(zhì)的行為反應，結(jié)果如表1所示。從表1可算出苯甲醛的誘集率為63.33%，t檢驗結(jié)果表明苯甲醛的誘集率顯著高于對照（P＜0.01）；其余3種氣味物質(zhì)與對照組無顯著性差異。

表1 赤擬谷盜對4種氣味物質(zhì)的行為反應Table 1 Behavioral response of T.castaneum to 4 volatiles

3 討論與結(jié)論

赤擬谷盜觸角與電極的連接是EAG測量的關鍵，觸角與電極的連接質(zhì)量將直接影響測試信號的穩(wěn)定性和獲得數(shù)據(jù)的可靠性。赤擬谷盜觸角較小，只有約1 mm，連接難度大，每次連接應采取相同的操作方法以保證基本相同的連接質(zhì)量。剛連接好的觸角，獲得的信號可能不穩(wěn)定，此時應待信號穩(wěn)定后，方可進行測量。

在測量過程中，當赤擬谷盜觸角末端膨大的三節(jié)浸入記錄電極內(nèi)的Kaisaling液時，很難獲得反應信號。因此，赤擬谷盜觸角末端不應插入Kaisaling液內(nèi)，但應保證觸角與Kaisaling液的接觸，使得觸角獲得刺激物的充分刺激；同時我們猜測，赤擬谷盜觸角末端膨大的三節(jié)可能聚集了大量的味覺感受器。在以后的測試工作中，還可以用Kaisaling液浸沒赤擬谷盜觸角末端不同的小節(jié)，以分析末端不同的小節(jié)對物質(zhì)的感受作用。

溫度對信號的測量也有影響。室內(nèi)溫度低于25℃時，有時將無法獲得測試信號，室溫28℃更有利于測試的進行。未來還應進行不同溫度下的測量研究，以獲得最佳的測試環(huán)境溫度。

已有的研究表明，昆蟲對某些化學信息物質(zhì)的觸角電位反應與行為反應一致，而對另外一些化學信息物質(zhì)的則不相關甚至負相關[20]。本試驗中赤擬谷盜對4種氣味物質(zhì)都表現(xiàn)出了EAG反應，但只有苯甲醛對赤擬谷盜有顯著的引誘效果。因此，要確定氣味物質(zhì)對昆蟲的活性，還需要到實際環(huán)境中進行試驗，因為實際環(huán)境中存在的氣味物質(zhì)更為復雜，這可能對所測試的信息物質(zhì)產(chǎn)生干擾[21]。不過，EAG數(shù)據(jù)至少可以表明赤擬谷盜可以檢測到哪些化學物質(zhì)，這有助于明確赤擬谷盜的嗅覺反應特點，更有針對性地發(fā)掘?qū)Τ鄶M谷盜有生物活性的信息物質(zhì)。

［1］ 曹陽，張建軍.赤擬谷盜磷化氫抗性及快速測定方法研究［J］.糧食儲藏，2000（1）:10-16.

［2］ 呂建華，王新民，白旭光，等.4種植物精油對赤擬谷盜的控制作用研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2006（9）:68-71.

［3］ 呂建華，鐘建軍，王潔靜，等.不同溫度處理對赤擬谷盜的致死作用［J］.河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2012（2）:11-14.

［4］ 柴曉樂，李坤，游秀峰，等.對赤擬谷盜成蟲具驅(qū)避性的芳香植物的正交篩選［J］.河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2009（5）:54-58.

［5］ RAJENDRAN S，SRIRANJINI V.Plant products as fumigants for stored-product insect control［J］.Journal of Stored Products Research，2008，44（2）:126-135.

［6］ 郭線茹，原國輝，蔣金煒，等.植物揮發(fā)性次生物質(zhì)對昆蟲觸角電位反應的影響［J］.河南農(nóng)業(yè)大學學報，2003（1）:18-22.

［7］ MYRICK A J，BAKER T C.Locating a compact odor source using a four-channel insect electroantennogram sensor［J］.Bioinspiration&Biomimetics，2011，6（1）:016002.

［8］ NGUMBI E，CHEN L，F(xiàn)ADAMIRO H Y.Comparative GC-EAD responses of a specialist（Microplitis croceipes） and a generalist（Cotesiamarginiventris） parasitoid to cotton volatiles lnduced by two caterpillar species［J］.Journal of Chemical Ecology，2009， 35（9）:1009-1020.

［9］ 趙冬香，盧芙萍，莫圣書，等.幾種植物揮發(fā)物對椰心葉甲成蟲的觸角電生理活性［J］.熱帶作物學報，2006（3）:66-69.

［10］田厚軍，陳藝欣，黃玉清.昆蟲觸角電位技術(shù)的研究進展 ［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2011（5）:907-910.

［11］高景林，盧芙萍，趙冬香，等.綠鱗象甲對11種揮發(fā)物的EAG反應及對4種寄主的選擇性［J］.熱帶作物學報，2012（9）:1677-1680.

［12］張立娟.綠盲蝽寄主選擇性及其機理研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2010.

［13］韓寶瑜，張鐘寧，方宇凌.小菜蛾對白菜揮發(fā)性次生物質(zhì)的觸角電生理和行為反饋［J］.科學通報，2001（16）:1384-1387.

［14］王四寶，周弘春，苗雪霞，等.松褐天牛觸角感器電鏡掃描和觸角電位反應［J］.應用生態(tài)學報，2005（2）:317-322.

［15］魯玉杰，張孝羲.棉鈴蟲雄蟲對人工合成性信息素的觸角電位反應［J］.河南農(nóng)業(yè)大學學報，2004（1）:49-53.

［16］車江萍.二疣犀甲對椰子心葉揮發(fā)物的反應及其嗅感器超微結(jié)構(gòu)研究［D］.?？冢汉Ｄ洗髮W，2012.

［17］劉勇，陳巨蓮，倪漢祥.麥長管蚜和禾谷縊管蚜對小麥揮發(fā)物的觸角電位反應［J］.昆蟲學報，2003（6）:679-683.

［18］劉勇.小麥—麥蚜—天敵互作關系研究［D］.杭州：浙江大學，2001.

［19］段立清，劉寬余，IMRE，等.木虱嚙小蜂對枸杞、枸杞木虱的行為反應［J］.昆蟲學報，2005（5）:725-730.

［20］黃恩炯.八種昆蟲對蓖麻毒素和相思豆毒素觸角電位及行為反應的研究［D］.北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2008.

［21］李為爭，楊雷，申小衛(wèi)，等.金龜甲對蓖麻葉揮發(fā)物的觸角電位和行為反應［J］.生態(tài)學報，2013（21）:6895-6903.

Abstract：The method of using semiochemicals to monitor and control Tribolium castaneum (Herbst)was investigated by testing its vitro antenna.Meanwhile，the basic operation methods and environmental conditions in the process of the EAG test and the adaptability and duration of EAG response of vitro antennas were also investigated.EAG and behavioral responses of T.castaneum to 4 wheat volatiles and their relationship were tested and analyzed.The results showed that the minimum interval between the two stimuli was 60 s in the EAG test;the change of EAG value within 30 min is about 5%.In a certain concentration range，the EAG and behavioral response values of T.castaneum to 4 volatiles increased with the increase of the concentration of volatiles，but significantly decreased to more than 5 μg/μL of methyl salicylate.In behavior tests，benzaldehyde exhibited certain attraction effects to the insects.There existed certain correlation and difference between the EAG and behavioral response values of T.castaneum to 4 volatiles.Therefore，the bioactivity of volatiles on the insects still need to be further determined in practical environment.

ELECTROANTENNOGRAM(EAG)AND BEHAVIORAL RESPONSES OF TRIBOLIUM CASTANEUM(HERBST)TO 4 WHEAT VOLATILES

DONG Zhen1，WANG Zhongming2，ZHANG Hongqing2，ZHANG Tao2，WU Yi2，JIANG Yajie1，ZHANG Mo2，LIN Lisha3，CAO Yang2
（1.School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Academy of State Administration of Grain， Beijing 100037，China；3.Fujian Research Institute of Cereal and Oil Science and Technology，F(xiàn)uzhou 350025，China）

Tribolium castaneum(Herbst)；wheat volatiles；EAG；behavioral response

TS210

B

1673-2383(2017)03-0056-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.020.html

網(wǎng)絡出版時間：2017-6-21 10:50:46

2016-10-07

國家國際科技合作項目（2013DFA31960）；國家糧食公益專項（201513002-01）

董震（1989—），男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向為農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治。

*通信作者