刁雅欣劉德星邱德義*劉環(huán)宇

（1.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東中山 528403；2.廣東藥科大學(xué)）

應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒別燕窩的基源

刁雅欣1，2劉德星1邱德義1*劉環(huán)宇2

（1.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東中山 528403；2.廣東藥科大學(xué)）

利用DNA條形碼技術(shù)對燕窩進(jìn)行基源鑒別。提取燕窩基因組DNA，選擇多細(xì)胞動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素氧化酶I（CO I）的通用引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物測序分析后，輸入GenBank中進(jìn)行BLAST搜索，分析樣品遺傳距離、構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光PCR法對燕窩中是否摻有豬源性成分進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，收集的15個(gè)樣品中，13個(gè)樣品與爪哇金絲燕Aerodramus fuciphagus的CO I DNA序列相似度高于 99%，其余2個(gè)樣品無法獲取目的PCR產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示15個(gè)樣品的Ct值均大于 35，樣品檢測含豬源成分呈陰性。因此，DNA條形碼技術(shù)為判斷燕窩的基源提供了一個(gè)可行方法。

燕窩；DNA條形碼；CO I序列；實(shí)時(shí)熒光PCR

1 前言

燕窩為金絲燕屬（Aerodramus或Collocalia）鳥類用唾液與絨羽等混合凝結(jié)而筑成的巢窩[1]，最早記載于《本草備要》和《本經(jīng)逢原》[2]。商品燕窩主要包括官燕、毛燕和草燕 3類[3]，按形狀可以分為燕盞、燕條、燕碎、燕餅、燕角、燕網(wǎng)等[4]，不同品種的燕窩價(jià)格和質(zhì)量差異巨大。燕窩是我國傳統(tǒng)的滋補(bǔ)佳品，其主要活性成分是唾液酸，而唾液酸被認(rèn)為在增強(qiáng)人體免疫力中有著重要作用[5]，另外天然燕窩的采集十分困難和危險(xiǎn)[6]，這些因素導(dǎo)致天然燕窩的價(jià)格十分高昂。

燕窩的產(chǎn)地包括印度尼西亞、馬來西亞、泰國、越南、菲律賓和中國，主要集中在東南亞。其中印度尼西亞占全球總產(chǎn)量的80%，馬來西亞13%，泰國約5%，并且不同產(chǎn)地的燕窩也有較大差異。截止2016年，國家質(zhì)檢總局進(jìn)出口食品安全局公布的允許進(jìn)口食用燕窩注冊企業(yè)僅有馬來西亞16家、印度尼西亞6家。但國內(nèi)市場不乏通過其他非法渠道入境或通過個(gè)別旅客攜帶物入境燕窩，在逃避檢驗(yàn)檢疫的同時(shí)，也帶來了較大的潛在食品安全和生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

在利益驅(qū)使下，國內(nèi)外一些不法分子對燕窩摻假或造假的行為日益嚴(yán)重，并且造假水平越來越高。假燕窩不僅擾亂了燕窩的市場秩序，還會(huì)對消費(fèi)者的利益和身體健康造成危害。2015年10月27日，國家質(zhì)檢總局進(jìn)出口食品安全局發(fā)布了關(guān)于對進(jìn)口含燕窩成分食品監(jiān)管要求的警示通報(bào)。因此，如何快速、準(zhǔn)確鑒別燕窩的真假，以及鑒別摻假燕窩中成分等問題亟需解決。燕窩的摻假手段包括染色、漂白、摻涂膠體、摻粘廉價(jià)燕窩等，常見的燕窩摻假物有銀耳、瓊脂、豬皮及蛋清等[6]。其中豬皮由于廉價(jià)且少量摻于燕窩中后肉眼難以辨別等特點(diǎn)，被作為燕窩的最常見摻假物。

隨著燕窩商品來源日益復(fù)雜，僅憑外觀特征和顯微鑒別已經(jīng)很難達(dá)到鑒別目的。目前已有檢測機(jī)構(gòu)以亞硝酸鹽、唾液酸含量等理化指標(biāo)用于燕窩質(zhì)量鑒別，但理化檢驗(yàn)尚存在局限性較大、專屬性不強(qiáng)等弱點(diǎn)，尤其是無法區(qū)別燕窩的基源、產(chǎn)地、等級等質(zhì)量問題[7]，普通的檢測方法還很難檢測出燕窩中的微量摻假物。分子生物學(xué)技術(shù)不僅快速、簡便、高通量，而且可以從界至種水平上系統(tǒng)鑒定生物種類，目前已廣泛應(yīng)用于出入境檢驗(yàn)領(lǐng)域[8]。DNA條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）為近年來國際上興起的一種新的物種鑒定方式，可從基因水平上對樣品的種類進(jìn)行鑒別。目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于生物物種、加工食品、真菌以及中藥材的鑒定[9-14]等廣大領(lǐng)域，但在燕窩中，利用最多的是Cytb和ND2基因，而不是動(dòng)物DNA條形碼通用基因-線粒體CO I基因，例如王鳳云[3]利用Cytb基因?qū)?2個(gè)商品燕窩樣品進(jìn)行檢測，有23個(gè)官燕窩基源為爪哇金絲燕A.fuciphagus，8個(gè)官燕窩為爪哇金絲燕的淡腰金絲燕亞種A.fuciphagus germani，1個(gè)毛燕窩的基源為大金絲燕A.maximus或其亞種A.maximus lowi。王鳳云[15]利用ND2基因?qū)ρ喔C樣品的基源進(jìn)行鑒別。林潔茹[16]利用Cytb基因?qū)碜杂《饶嵛鱽喌?3個(gè)燕窩樣品進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其來源均為爪哇金絲燕。

本研究嘗試將動(dòng)物DNA條形碼通用基因-線粒體CO I基因片段作為分子標(biāo)記，利用DNA條形碼技術(shù)對收集的燕窩進(jìn)行真假鑒定以及基源鑒別，檢驗(yàn)CO I基因是否適用于雨燕科鳥類的物種鑒定；進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對燕窩中是否摻有豬源性成分進(jìn)行檢測。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品來源

本研究以14個(gè)不同來源的商品燕窩和1個(gè)口岸截獲燕窩為材料。其中，14個(gè)商品燕窩的樣品采購自廣東省中山市藥店、市場等，包括1個(gè)毛燕和13個(gè)官燕，產(chǎn)地均為商家自報(bào)或者來自商品標(biāo)識。詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息

2.1.2 主要試劑

PCR擴(kuò)增所用引物：為多細(xì)胞動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素氧化酶 I（CO I）的通用引物 LCO1490（5’-GGT CAACAAATCATAAAGATATTGG-3’）和 HCO2198（5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’）[17，18]，由大連寶生物工程有限公司合成；DNA提取試劑盒（目錄號D P304）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（目錄號D P210）、PCR擴(kuò)增所需試劑：均購于天根生化科技（北京）有限公司；Taq DNA聚合酶：購于大連寶生物工程有限公司；豬源成分核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）：購于廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；DNA 裂解液（700mmol/L GuSCN、30mmol/L EDTA pH8.0、30mmol/L Tris-HCl pH 8.0、0.5%Triton X-100、5%Tween-20）：購于美國Amresco 公司。

2.2 方法

2.2.1 總DNA提取

2.2.1.1 燕窩DNA提取

稱取燕窩樣品50mg于1.5mL離心管中，加入無水乙醇清洗樣品以除去燕窩表面攜帶的細(xì)菌和其他可能的污染，用已滅菌的超純水1mL清洗樣品3次以除去樣品中殘留的無水乙醇。按照DNA提取試劑盒說明書操作步驟提取總DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1.2 燕窩中羽毛的DNA提取

挑選并稱取燕窩中的羽毛50mg，于1.5mL離心管中，加入無菌水浸泡，清除殘留的燕窩，加入無水乙醇清洗樣品以除去羽毛表面攜帶的細(xì)菌和其他可能的污染，用已滅菌的超純水1mL清洗樣品3次以除去樣品中殘留的無水乙醇，加入DNA裂解液200 μL和蛋白酶K 20 μL于 56℃裂解過夜。裂解完成后按照DNA提取試劑盒說明書裂解后的操作步驟提取總DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 PCR擴(kuò)增及測序

PCR 反應(yīng)體系為 50 μL：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，Taq 酶 0.5μL，正反引物（10μmol/L）各 1 μL，模板 DNA（30 ng/μL）3 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃變性 3min；94℃變性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按照試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，測序引物同擴(kuò)增引物，由上海立菲科技有限公司完成。

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按試劑盒說明書配制反應(yīng) 25 μL體系（在冰盒上進(jìn)行）：A-Sus-P（混合反應(yīng)液）20 μL，待測燕窩模板5 μL。每次反應(yīng)均要配制NG-Sus-P（陰性對照）和PG-Sus-P（陽性對照）。反應(yīng)程序如下：95℃ 10min；95℃ 15 s，60℃ 1min，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線并分析結(jié)果。

2.2.4 序列分析

利用MEGA 6.0軟件對測序所得樣品的序列進(jìn)行拼接，去除引物，得到全長有效序列為 658 bp。通過查看序列的原始峰圖檢查序列及登陸網(wǎng)址：www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/，將拼接好的序列進(jìn)行氨基酸翻譯，進(jìn)一步校對序列的質(zhì)量。將所得序列輸入GenBank中進(jìn)行Blast搜索，對燕窩進(jìn)行物種鑒定。利用軟件MEGA 6.0計(jì)算燕窩樣品的Jukes-Cantor model遺傳距離，選擇也可以產(chǎn)出燕窩的雨燕科雨燕屬的白腰雨燕Apus pacificus[19]作為外群，用ClustalW分析燕窩樣品和其他相近序列并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果

3.1 序列分析

收集的14個(gè)商品燕窩樣品和 1個(gè)口岸截獲的燕窩樣品中，13個(gè)樣品得到目的DNA序列片段，樣品YF燕絲和YG燕碎經(jīng)多次核酸提取嘗試，獲得的DNA濃度均小于 5 ng/μL，260/280核酸純度均小于1.0，無法獲得足夠的DNA模板。將13個(gè)商品燕窩樣品的CO I序列上傳至GenBank，基因序列號見表2，并在GenBank中進(jìn)行BLAST搜索，結(jié)果顯示，商品燕窩樣品中相似性最高的序列均為雨燕科金絲燕屬的爪哇金絲燕，與其最相似序列的相似度均高于99%，Evalue值均為0，確認(rèn)13個(gè)商品燕窩樣品來源于爪哇金絲燕。口岸截獲燕窩的羽毛與燕窩樣品檢測結(jié)果經(jīng)上述分析，確認(rèn)兩者來源均為爪哇金絲燕。

表2 分析樣品的基源物種的GenBank序列號

3.2 燕窩樣品基于CO I基因的Jukes-Cantor model遺傳距離

利用MEGA6.0軟件，將13個(gè)樣品序列計(jì)算Jukes-Cantor model遺傳距離，見表3。所有樣品之間的遺傳距離在0.000-0.008之間，根據(jù)DNA條形碼的物種鑒定規(guī)則[18]，可認(rèn)為13個(gè)樣品均來源于同一基源。

表3 基于CO I基因的Jukes-Cantor model遺傳距離

（續(xù)表3）

3.3 燕窩樣品與相近物種的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

下載GenBank中金絲燕屬所有物種的6條CO I序列，選取也能產(chǎn)出燕窩的雨燕科雨燕屬的白腰雨燕Apus pacificus作為外群，詳見表4。下載的序列和所測得13個(gè)樣品共21個(gè)序列用于構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。13個(gè)樣品的基源均為爪哇金絲燕，支持率為99%。

表4 從GenBank中下載用于構(gòu)建發(fā)育樹的序列

圖1 基于CO I序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（Kimura 2-parameter model）

3.4 燕窩樣品中豬源性成分核酸檢測

對15個(gè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性，詳見圖2。試劑盒對豬源性成分的檢出限為0.1%，按照說明書要求設(shè)定基線和閾值線。結(jié)果顯示，所有樣品Ct值均大于35，樣品呈陰性，即所有樣品不含豬源性成分或含量低于檢測限。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖

4 討論

本研究一共收集了4個(gè)產(chǎn)地，5種形狀共15種燕窩產(chǎn)品，利用DNA條形碼技術(shù)對燕窩樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：14個(gè)商品燕窩樣品和1個(gè)截獲的樣品中中有13個(gè)樣品基源為爪哇金絲燕，有2個(gè)燕窩樣品（YF、YG）多次提取后仍未獲得目的DNA片段，此2個(gè)樣品是和其他13個(gè)樣品使用同樣的試劑、同一個(gè)人、同批同時(shí)處理，因此可以排除試劑或者操作造成的模板DNA提取失敗的人為原因；口岸截獲燕窩樣品中羽毛與樣品基源為爪哇金絲燕。對15個(gè)燕窩樣品中豬源性成分進(jìn)行核酸檢測的結(jié)果表明樣品均不含豬源性成分。本研究結(jié)果與前人的研究基本吻合，且同一燕窩樣品中的羽毛鑒定結(jié)果與燕盞鑒定結(jié)果完全一致，進(jìn)一步證實(shí)了利用DNA條形碼技術(shù)鑒定燕窩真假、鑒別燕窩基源的可行性。與前人研究相比，本研究選擇動(dòng)物物種通用的DNA條形碼基因-CO I基因，此序列保守性適中，非常適合物種的鑒定[18]，且獲得技術(shù)簡單，更適合快速鑒定燕窩基源及真?zhèn)舞b別。

在GenBank中查找金絲燕屬物種基因組序列時(shí)發(fā)現(xiàn)共有700余條金絲燕屬物種的基因，但其中CO I序列僅有8條，其余序列大多為Cytb和ND2序列。后續(xù)研究將繼續(xù)擴(kuò)充燕窩樣本量，進(jìn)一步探索產(chǎn)地不同、基源相同的商品燕窩在基因上的差異，以此來解決市場上燕窩標(biāo)示產(chǎn)地與實(shí)際產(chǎn)地不符等問題，為消費(fèi)者的權(quán)益提供保障。同時(shí)提醒，國家質(zhì)檢總局對食用燕窩的進(jìn)口執(zhí)行境外企業(yè)備案制度，目前僅16家馬來西亞企業(yè)和6家印度尼西亞企業(yè)獲準(zhǔn)生產(chǎn)與出口食用燕窩到中國大陸，其他非法渠道及旅客攜帶入境者存在較大的食品安全與生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

燕絲、燕餅等燕窩制品由于形態(tài)破壞，通過常規(guī)手段較難準(zhǔn)確檢驗(yàn)，DNA條形碼技術(shù)能夠在分子水平上對燕窩進(jìn)行真?zhèn)舞b定以及基源的快速檢測，不受樣品形態(tài)影響；DNA條形碼技術(shù)分類簡便且高效，對鑒定人員的知識背景及經(jīng)驗(yàn)要求較低，為運(yùn)用于實(shí)際的鑒定和檢驗(yàn)工作提供了可能性。

5 結(jié)論

DNA條形碼技術(shù)分類簡便且高效，為判斷燕窩的基源提供了一個(gè)可行的方法。

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Application of DNA Barcoding Technique to the Identification of the Original Species of Cubilose

DIAO Yaxin1，2， LIU Dexing1， QIU Deyi1*， LIU Huanyu2
（1.Zhongshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhongshan， Guangdong，528403；2.Guangdong Pharmaceutical University）

To identify the original species of cubilose by DNA Barcoding technique，Genomic DNA was extracted from cubilose and PCR was performed with the metazoan Mitochondrial Cytochrome Oxidase I（CO I）degenerate primers.The amplified sequence was aligned in the GenBank database，the nearest distances were calculated and a NJ-tree was built as well.Real-time PCR was applied to detect whether swine-originated ingredient was mixed in the cubilose or not.The results showed that 13 out of the 15 collected samples，CO I DNA sequence similarities to Aerodramus fuciphagus were higher than 99%，and the target PCR products could not be obtained from the other 2 samples.Results of the Real-time PCR showed that Ct values of the 15 samples were all over 35，swine-originated ingredient was not detected.DNA barcoding is a potential technical tool to identify the original species of the edible cubilose.

Cubilose；DNA Barcoding；CO I Sequence；Real-Time PCR

Q789

E-mail：m17727517027@163.com；*通訊作者E-mail：qiudy@zs.gdciq.gov.cn

中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A2FC249）

2016-12-27