李紅娜袁 飛張辰暘馬文良羅云敬*張 峰**

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院 北京 100124；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院）

副溶血弧菌耐熱直接溶血素4種亞基制備條件的研究

李紅娜1，2袁 飛2張辰暘1馬文良1羅云敬1*張 峰2**

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院 北京 100124；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院）

耐熱直接溶血素是副溶血弧菌的主要毒素，耐熱直接溶血素的制備對進(jìn)一步建立副溶血弧菌毒素檢測方法有很重要的意義。本項目研究了培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對耐熱直接溶血素1、2、3、4等亞基表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)溫度為28℃時最適合耐熱直接溶血素亞基的制備。溫度低于28℃或高于28℃時，耐熱直接溶血素亞基的表達(dá)量都較低。培養(yǎng)時間為8-12 h時，耐熱直接溶血素亞基的制備量達(dá)到最大，增加培養(yǎng)時間后，制備量卻有明顯下降趨勢。另外，還對影響酶切去重組耐熱直接溶血素亞基標(biāo)簽效率的影響因素進(jìn)行了研究，包括酶切溫度、酶添加量等。結(jié)果顯示，從15℃到40℃，隨著酶切溫度的升高，酶切效率逐漸增大；隨著酶添加比例的增加，酶切效率逐漸增大，當(dāng)酶添加比例為1∶20時，酶切效率達(dá)到最大。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對于耐熱直接溶血素亞基的制備具有較大的影響；酶切溫度和酶添加比例對去標(biāo)簽效率也具有影響。

副溶血弧菌；耐熱直接溶血素亞基；表達(dá)；培養(yǎng)溫度；培養(yǎng)時間

1 前言

副溶血弧菌是海產(chǎn)品引起食物中毒的常見病原菌，適合生長的溫度范圍為15℃-44℃[1]。耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱直接相關(guān)溶血素（TRH）是副溶血弧菌兩個主要的毒力因子，這兩種物質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似，都由二聚體構(gòu)成，并有相似的溶血活性[2]。吳永寧等[3]對中國2003-2008年間由副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒事件進(jìn)行了總結(jié)，該致病菌可引起人急性腸胃炎，使人發(fā)生惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀[4]。副溶血弧菌引起人食物中毒常發(fā)生在4月到10月份，常見引起中毒食物為肉及肉制品、海產(chǎn)品等，通常表現(xiàn)為交叉污染。副溶血弧菌引起人類疾病的途徑除了飲食外，還可以通過皮膚接觸產(chǎn)生。如人類皮膚接觸到被副溶血弧菌污染的水后會引起傷口感染、腸胃炎或者敗血癥等[5]。因此對于副溶血弧菌的監(jiān)測除了市場上流通的海產(chǎn)品，還需對娛樂水域的水環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測。Sadok Khouadja等[6]研究表明，非致病性的副溶血弧菌可能是毒力基因庫，可水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生新型致病副溶血弧菌。

本項目的目的是通過大腸桿菌表達(dá)TDH亞基，為后續(xù)副溶血弧菌檢測做準(zhǔn)備[7-9]。由于TDH是副溶血弧菌的主要毒力因子，因此外界環(huán)境對TDH亞基制備的影響，對副溶血弧菌毒素制備從而進(jìn)一步建立副溶血弧菌毒素檢測方法具有很重要的意義。本項目對影響TDH表達(dá)量的培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間進(jìn)行了研究，并且還研究了影響酶切去標(biāo)簽的酶切溫度、酶的比例及酶切時間。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

瓊脂粉、異丙基硫代半乳糖苷（純度99%）、NaCl（分析純）、KH2PO4（分析純）、NaH2PO4（分析純）、KCl（分析純）、NaOH（分析純）、Tris（純度≧99.9%）、十二烷基硫酸鈉（純度99.5%）、二硫蘇糖醇（純度 98%）、溴酚藍(lán)（純度 99%）、甘油（分析純）、丙烯酰胺（分析純）、過硫酸銨（分析純）、四甲基乙二胺（純度99%）、甘氨酸（純度99%）、考馬斯亮藍(lán)（純度99.9%）、乙醇（分析純）、硫酸（分析純）、包涵體溶解液、卡那霉素、鎳瓊脂糖、非干擾型蛋白濃度測定試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌（BL21）和質(zhì)粒pET28a等：全部購于生工（中國，上海）；乙腈：購于賽默飛世兒（美國，馬薩諸塞州）；去離子水：由Milli-Q（德國，達(dá)姆施塔特）制備。

2.1.2 儀器

全溫震蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F280）：太倉華美（中國，蘇州）；圖像掃描儀（Image scanne Ⅲ）：通用（康涅狄格，美國）；超聲波細(xì)胞破碎儀（JY88-Ⅱ）：新芝生物（中國，寧波）；低速冷凍離心機(jī)（DL-5M）：湘儀（中國，長沙）；高速冷凍離心機(jī)（HC-3018R）：中科中佳（中國，安徽）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162）：太倉華利達(dá)（中國，蘇州）；可見分光光度計（V-1800）：美譜達(dá)（中國，上海）：恒溫槽（SC-15）：天恒（中國，寧波）；超凈工作臺（YJ-1450）：康旺（中國，蘇州）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（YM50）：三申（中國，上海）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101A-3E）：上海實(shí)驗(yàn)室儀器廠（中國，上海）；迷你雙立式電泳槽（DYCZ-24DN）：六一（中國，北京）。

2.2 方法

2.2.1 溶液配制

（1）LB培養(yǎng)基：25.000 g LB瓊脂粉加入到1.0 L蒸餾水中，混勻后高壓蒸汽滅菌。

（2）異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）工作液：稱取24.000 g IPTG固體粉末溶于100mL蒸餾水中，充分混勻。

（3）磷酸鹽緩沖溶液（10×PBS，pH7.4）：稱取 80.000g NaCl、2.000 g KH2PO4、21.700 g NaH2PO4和 2.000 g KCl，然后加入1.0 L雙蒸水，充分混勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4。

（4）蛋白上樣緩沖液（5×）：稱取 37.920 g Tris、100.000 g十二烷基硫酸鈉（SDS）、75.000 g二硫蘇糖醇（DTT）和0.500 g溴酚藍(lán)，量取500.00mL甘油，加雙蒸水定容至1.0 L，充分混勻。

（5）5%濃縮膠：量取 1.44mL 雙蒸水、416.7 μL 30%丙烯酰胺、623.0 μL 緩沖液、25.0 μL 10%SDS、12.5 μL過硫酸銨（APS）和 2.5 μL四甲基乙二胺（TEMED），充分混勻。

（6）12%分離膠：量取2.50mL雙蒸水、3.00mL 30%丙烯酰胺、1.88mL 緩沖液、75.0 μL 10%SDS、30.0 μL10%APS 和 15.0 μL TEMED，充分混勻。

（7）10×Tris-Gly 緩沖溶液：稱取 30.000 g Tris、144.000 g甘氨酸和10.000 g SDS，加雙蒸水定容至1.0 L，充分混勻。

（8）考馬斯亮藍(lán)工作液（CBB）：稱取 0.200g CBB，量取100.00mL 95%乙醇和200.00mL 85%磷酸，加雙蒸水定容至2.0 L，充分混勻后過濾。

（9）柱平衡液A和B、除雜液D及洗脫液C：柱平衡液A和B、除雜液D及洗脫液C的配制方法見表1。

表1 溶液A、B、C和D的配制方法

2.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及重組細(xì)菌產(chǎn)毒培養(yǎng)

取1μL重組質(zhì)粒 pET28a轉(zhuǎn)化100 μL感受態(tài)大腸桿菌（BL21），42℃下熱擊 90 s，然后在冰上靜置2min。取50 μL轉(zhuǎn)化好的重組BL21于30%卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)化成功的BL21可在30%卡那霉素的LB培養(yǎng)基上生長增殖，均勻分布。挑取轉(zhuǎn)化成功的BL21菌株于30%卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃、220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取菌培養(yǎng)液于新的30%卡那霉素LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，菌液和培養(yǎng)基的比例為1∶100，37℃、220 rpm振蕩培養(yǎng)3 h。當(dāng)菌液濃度達(dá)到0.6 OD時，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，220 rpm、28℃下誘導(dǎo)產(chǎn)毒培養(yǎng)12 h。

2.2.3 離心收集表達(dá)重組TDH亞基的菌體

取誘導(dǎo)產(chǎn)毒培養(yǎng)的菌液于離心管中，4000 rpm離心10min，去上清，收集沉淀，含表達(dá)重組TDH亞基的菌體用破碎緩沖液重懸，放置冰浴中超聲（400W，20min）破碎菌體，釋放重組TDH亞基。重組TDH亞基溶于上清液中，離心收集上清液，12 000 rpm離心20min。

2.2.4 重組TDH亞基純化。

將重組TDH亞基提取液經(jīng)過鎳瓊脂糖層析柱進(jìn)行純化，鎳瓊脂糖層析柱用5mL Ni-IDA填充。將適量的提取液加入到鎳瓊脂糖層析柱中，用200mL A液沖洗層析柱，然后用200mL B液沖洗層析柱，再用50mL D液沖洗層析柱，最后用200mL C液洗脫重組TDH亞基，并收集洗脫液。

2.2.5 去標(biāo)簽

重組TDH亞基所帶標(biāo)簽為組氨酸標(biāo)簽（histidine-tag），histidine-tag 與 TDH 亞基之間通過腸激酶識別位點(diǎn)（DDDDK）相連，因此選用腸激酶（enterokinase，EK）切割 histidine-tag。純化后的重組TDH亞基提取液和EK按照70∶1（m：m）的比例混合均勻后，置于40℃水浴中酶切6 h。

2.2.6 去標(biāo)簽TDH亞基純化

酶切混合液通過鎳瓊脂糖層析柱進(jìn)行純化。沒有去掉histidine-tag的重組TDH亞基和histidinetag會保留在鎳瓊脂糖層析柱中，去掉標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白TDH亞基則不能在鎳瓊脂糖層析柱中保留。將酶切混合液加入到鎳瓊脂糖層析柱中，加入100mLB液洗脫去標(biāo)簽TDH亞基，并收集洗脫液，去標(biāo)簽TDH亞基即為TDH亞基。將洗脫液脫鹽后，-80℃保存，凍干。

酶切混合液通過鎳瓊脂糖層析柱進(jìn)行純化，沒有去掉histidine-tag的重組TDH亞基和histidinetag會保留在鎳瓊脂糖層析柱中，去掉標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白TDH亞基則不能在鎳瓊脂糖層析柱中保留。將酶切混合液加入到鎳瓊脂糖層析柱中，加入100mL B液洗脫TDH亞基，并收集洗脫液，去標(biāo)簽TDH亞基即為TDH亞基。將洗脫液脫鹽后，-80℃保存，凍干。

3 結(jié)果與討論

3.1 溫度對重組TDH亞基表達(dá)的影響

對溫度作為影響重組TDH亞基表達(dá)的因素進(jìn)行了研究，研究的溫度范圍為15℃、20℃、28℃和37℃。培養(yǎng)結(jié)束后，4 000 rpm離心10min收集菌體，然后用破碎緩沖液（PBS，pH7.4）重懸后，超聲6min破碎菌體，12 000 rpm離心20min，收集上清液。分別將 15℃、20℃、28℃和 37℃得到的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果見圖1-圖4。

圖1 不同溫度下TDH1亞基的表達(dá)

圖2 不同溫度下TDH2亞基的表達(dá)

圖3 不同溫度下TDH3亞基的表達(dá)

圖4 不同溫度下TDH4亞基的表達(dá)

圖1-圖4顯示，從15℃-28℃，隨著培養(yǎng)溫度的升高，重組TDH亞基電泳條帶逐漸變寬，顏色逐漸加深，重組TDH亞基的表達(dá)量逐漸增加，28℃時，重組TDH亞基的表達(dá)量達(dá)到最大值；而從28℃-37℃，重組TDH亞基的電泳條帶變窄，顏色變淺，重組TDH亞基的表達(dá)量下降。因此，溫度對于重組TDH的表達(dá)有很大影響，這可能是在低于30℃的條件下時，適合于細(xì)菌表達(dá)次級代謝產(chǎn)物，但是溫度過低則使細(xì)菌內(nèi)的某些代謝酶活性降低。

3.2 培養(yǎng)時間對重組TDH亞基表達(dá)的影響

對培養(yǎng)時間作為影響重組TDH亞基表達(dá)的因素進(jìn)行了研究。分別在 28℃下培養(yǎng) 2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h，然后 4 000 rpm 離心 10min，分別收集菌體，用PBS重懸后，超聲破碎菌體，12 000 rpm離心20min，收集上清液，然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖5-圖8。

圖5 不同培養(yǎng)時間下TDH1亞基的表達(dá)

圖6 不同培養(yǎng)時間下TDH2亞基的表達(dá)

圖7 不同培養(yǎng)時間下TDH3亞基的表達(dá)

圖8 不同培養(yǎng)時間下TDH4亞基的表達(dá)

圖5-圖8顯示，從2-8 h，隨著培養(yǎng)時間的增加，重組TDH亞基的電泳條帶逐漸變寬，顏色加深，重組TDH亞基的表達(dá)量增加，在8-12 h間重組TDH亞基表達(dá)量達(dá)到最大；12 h后，隨著培養(yǎng)時間的增加，重組TDH亞基的電泳條帶變窄，顏色變淺，重組TDH亞基的表達(dá)量下降。因此，培養(yǎng)時間對于重組TDH亞基的表達(dá)量也有很大影響，12 h后重組TDH亞基表達(dá)量下降的原因可能為，在12 h后細(xì)菌出現(xiàn)衰亡現(xiàn)象，菌體內(nèi)容物溢出，導(dǎo)致重組TDH亞基被降解。

3.3 酶切溫度對去標(biāo)簽效果的影響

對酶切溫度作為影響酶切效率的因素進(jìn)行了考察。將酶切溫度設(shè)為 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃ 6個組，取1mL純化提取液，加入 10 μL EK（0.6mg/mL），平行6組，分別在上述6個溫度下進(jìn)行酶切12 h，將酶切混合液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖9-圖12。

圖9-圖12顯示，從 15℃到 30℃之間，隨著酶切溫度的升高，重組TDH亞基的電泳條帶逐漸變窄，顏色變淺，而TDH亞基的電泳條帶逐漸變寬，顏色逐漸變淺，酶切效率逐漸升高；酶切溫度為35℃時，酶切效率達(dá)到最大；酶切溫度從35℃到40℃時，酶切效率基本不變。酶切溫度對于酶切效率的影響不可忽視。

3.4 酶與底物的比例對酶切效率的影響

對酶添加比例作為酶切效率的影響因素進(jìn)行了考察。按照 0∶1，1∶10，1∶20，1∶50，1∶80，1∶100 的比例加入EK（0.6mg/mL），重組TDH亞基提取液的濃度為2mg/mL。將各組分置于35℃水浴中酶切12 h，然后將不同酶比例的酶切混合液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖13-圖16。

圖9 不同酶切溫度的酶切效果

圖10 不同酶切溫度的酶切效果

圖11 不同酶切溫度的酶切效果

圖12 不同酶切溫度的酶切效果

圖13-圖16顯示，從1∶100到1∶20之間，隨著酶比例的增加，重組TDH亞基的電泳條帶逐漸消失，酶切效率逐漸增加；酶添加比例為1∶20時，酶切效率基本達(dá)到100%。酶添加比例到一定程度達(dá)到飽和，為避免不必要的浪費(fèi)，酶添加比例為1∶20即可。

圖13 不同酶與底物比例的酶切效果

圖14 不同酶與底物比例的酶切效果

圖15 不同酶與底物比例的酶切效果

圖16 不同酶與底物比例的酶切效果

3.5 酶切時間對重組TDH亞基去標(biāo)簽效果的影響

對酶切時間對酶切效率的影響進(jìn)行了考察。分別按照體積比1∶20加入EK，然后在35℃的水浴中分別酶切 0h、2 h、6h、12 h、24h、36h、48h，然后將酶切混合液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖17-圖20。

圖17-圖20顯示，從0-12 h，隨著酶切時間的增加，重組TDH亞基的電泳條帶逐漸消失，酶切12 h后，酶切效率基本達(dá)到100%。為了減少實(shí)驗(yàn)所需時間，酶切時間的考察十分必要。

圖17 不同酶切時間的酶切效果

圖18 不同酶切時間的酶切效果

圖19 不同酶切時間的酶切效果

圖20 不同酶切時間的酶切效果

4 結(jié)論

（1）通過對培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對TDH亞基制備的影響研究發(fā)現(xiàn)，TDH最適表達(dá)的溫度為28℃左右。這個結(jié)果提示氣溫為28℃左右時，可能為副溶血弧菌產(chǎn)毒的有利條件。因此，當(dāng)氣溫接近28℃時，應(yīng)該注意防范副溶血弧菌可能帶來的食物中毒風(fēng)險。當(dāng)培養(yǎng)時間為8-12 h時，TDH亞基的表達(dá)量達(dá)到最大，但12 h之后TDH亞基的表達(dá)量明顯下降。這個結(jié)果提示，當(dāng)培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)基本被消耗掉后，菌體繁殖能力降低，發(fā)生自溶現(xiàn)象，胞內(nèi)各種酶類物質(zhì)釋放，導(dǎo)致TDH亞基被降解。研究表明，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間均對TDH亞基的制備有較大影響，是不能被忽視的因素。

（2）對影響酶切效率的因素進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示酶切溫度和酶添加量對于酶切效率有很大影響。為了提高酶切效率，縮短實(shí)驗(yàn)所需時間，同時又避免不必要的浪費(fèi)，酶切溫度和酶添加量是必須要考察的因素。

（3）本研究為副溶血弧菌食物中毒的預(yù)防提供了依據(jù)。

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Environmental Factors on Preparation of Thermostable Direct Hemolysin Subunits

LI Hongna1，2， YUAN Fei2， ZHANG Chenyang1， MA Wenliang1， LUO Yunjing1*， ZHANG Feng2**
（1.College of Life Science and Bioengineering， Beijing University of Technology， Beijing， 100124；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine）

Thermostable direct hemolysins（TDHs）were the major virulence factros of vibrio parahaemolyticus.The expression of TDH was important to further study of vibrio parahaemolyticus detection.So environmental factors on expression of TDH subunits were studied in this paper，and the culture temperature and time were studied.The result showed that 28℃was most proper for expression of TDH subunits，and expression of TDH subunits was in low level when culture temperature below or above of 28℃.The expression of TDH subunits reached maximum within 8-12 h，however，the expression of TDH subunits was decreasing when culture time was over 12 h.In addition，influence factors on enzymatic digestion were investigated.The result showed that the enzymatic efficiency was increasing along with the enzymatic temperature ranged from 15℃ to 40℃ and enzyme ratio ranged from 1 ∶100 to 1∶20.The result suggested that culture temperature and time can affect the expression of TDH subunits，and enzymatic temperature and enzyme ratio can affect enzymatic efficiency.

Vibrio Parahaemolyticus；Thermostable Direct Hemolysins；Genetic Engineering Technology；Culture Temperature；Culture Time

Q789

E-mail：lihongna1@163.com；*通訊作者Email：luoyj@bjut.edu.cn；**通訊作者E-mail：fengzhang@126.com

公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費(fèi)項目（201510038）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK084）

2017-03-31