閆 焱，周 昆，易巧麗，樊青霞

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

Cat B和Cys C在食管癌組織中的表達(dá)

閆 焱1，周 昆2，易巧麗1，樊青霞1

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

目的 探討組織蛋白酶B(Cat B)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cys C)在食管癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用免疫組化及熒光定量PCR對56例食管癌及相對應(yīng)的癌旁正常食管黏膜組織中Cat B和Cys C表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果 與癌旁正常食管黏膜組織比較，食管癌組織中Cat B和Cys C的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)。Cat B和Cys C的表達(dá)顯著正相關(guān)(rs=0.970，P<0.05)。Cat B 和Cys C的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Cys C的表達(dá)還與腫瘤侵襲程度有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 Cat B和Cys C在食管癌組織中均呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤惡性程度相關(guān)，有望成為食管癌早期診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

組織蛋白酶B；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；食管癌

食管癌是世界范圍內(nèi)排名前10位的最常見惡性腫瘤之一，也是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。中國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，其死亡率僅次于胃癌。惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移常常是造成患者死亡的主要原因。組織蛋白酶B(Cathepsin B,Cat B)是一種溶酶體內(nèi)的半胱氨酸蛋白水解酶，其通過參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程和腫瘤血管生成等途徑在惡性腫瘤的發(fā)展中扮演著重要角色[1-3]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C,Cys C)作為組織蛋白酶抑制劑與組織蛋白酶互相作用在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到十分重要的作用[4-6]。本試驗(yàn)研究Cat B和Cys C在人食管癌組織中的表達(dá)，以評估Cat B和Cys C作為食管癌早期診斷分子標(biāo)志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 選取2009年3月至2011年5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的經(jīng)病理學(xué)確診的56例食管癌患者及其配對癌旁正常食管黏膜組織的手術(shù)切除標(biāo)本。正常食管黏膜組織取自切除食管斷端，距腫瘤切緣約5 cm，均經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)為正常食管黏膜組織。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或中藥等其他針對腫瘤的治療，新鮮組織采用手術(shù)分離并在術(shù)后立即置于液氮中，部分組織常規(guī)石蠟包埋。56例患者基線資料：男31例，女25例；年齡36～77歲，中位年齡為59.5歲；鱗癌39例，腺癌16例；高分化11例，中分化25例，低分化組20例；浸潤深度：T1(腫瘤只侵及黏膜下層或黏膜固有層)6例，T2(腫瘤侵及肌層)18例，T3(腫瘤侵及纖維膜)18例，T4(腫瘤侵及臨近結(jié)構(gòu))14例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。

1.2 免疫組化檢測中Cat B和Cys C表達(dá) 將標(biāo)本石蠟切片脫蠟，浸入0.01 mol·L-1構(gòu)椽酸鹽緩沖液中，加熱95 ℃保持15 min，滴加體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫，室溫下避光孵育。滴加Cat B和Cys C一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，1100)，入濕盒內(nèi)4 ℃過夜。次日滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，選用癌旁正常食管黏膜做切片內(nèi)陰性對照，陽性對照片由抗體公司提供。分別由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生在不知標(biāo)本臨床和病理資料的情況下獨(dú)立觀察切片，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分。意見一致者予以采納，意見不一致者重新商定。Cat B和Cys C陽性細(xì)胞均以細(xì)胞呈黃色、棕黃色、棕褐色顆粒為準(zhǔn)，著色高于背景，或背景不著色而細(xì)胞質(zhì)著色為陽性。采用Mattern的半定量積分法：根據(jù)著色深淺程度及著色陽性上皮細(xì)胞所占百分比(%)，對表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量評估分級，分為-、±、+、++，其中-為陰性，±、+、++為陽性。

1.3 熒光定量PCR檢測Cat B和Cys C mRNA表達(dá) Trizol試劑提取組織中RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)Cat B和Cys C的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，Cat B-QF，GCTACAGCCCGACCTACAAACAG，Cat B-QR，GAGCAGGAAGTCCGAATACACAGA，Cys C-QF CCGTCGGCGAGTACAACAAAG，Cys C-QR CCA-GCTCCACGTCCAAGAAGTAGT，GADPH-QF，AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，GADPH-QR，AGGGGCCATCCACAGT-CTTC。然后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測組織樣本中Cat B和Cys C蛋白的表達(dá) Cat B和Cys C在食管癌及癌旁正常食管黏膜組織中均有不同程度的表達(dá)。Cat B主要著色于細(xì)胞質(zhì)與鄰近細(xì)胞膜，食管癌和癌旁正常食管黏膜組織中蛋白陽性率分別為60.7%(34/56)及19.6%(11/56)(χ2=19.651，P<0.001)。食管癌組織中Cys C主要著色于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，少數(shù)細(xì)胞膜亦有表達(dá)，一些癌旁正常上皮組織中亦有較弱表達(dá)，食管癌和癌旁正常食管黏膜組織中Cys C蛋白陽性率分別為94.6%(53/56)及12.5%(7/56)(χ2=75.959，P<0.001)。食管癌組織中Cat B和Cys C的表達(dá)顯著正相關(guān)(rs=0.970，P<0.05)。見圖1。

2.2 食管癌組織中Cat B和Cys C的蛋白表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理特征的關(guān)系 Cat B 和Cys C的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Cys C的表達(dá)還與腫瘤侵襲程度有關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3 熒光定量PCR檢測組織樣本中Cat B和Cys C mRNA表達(dá) 以每例樣本自身癌旁正常食管黏膜組織為對照，食管癌組織中Cat B和Cys C mRNA的相對表達(dá)量均明顯升高(t=3.225，P<0.001)。見圖2。

3 討論

惡性腫瘤的特征性表現(xiàn)是浸潤和轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的半胱氨酸蛋白酶等多種水解酶能降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞黏膜屏障，促使腫瘤細(xì)胞穿透基底膜向深層組織浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。存在于細(xì)胞質(zhì)溶酶體中的Cat B屬于半胱氨酸蛋白酶的一種，可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)，如多型膠原、纖連蛋白等，參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。Cat B在前列腺癌、頭頸部癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)增高[8-11]。Cys C是Cat B最主要的抑制劑，可以與半胱氨酸蛋白酶結(jié)合形成酶-抑制劑復(fù)合物，從而阻止Cat B對間質(zhì)組織及基底膜的破壞作用，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[12-13]。Cys C在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，例如卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等[14-15]。然而，Yano等[7]在乳腺癌組織中得到了相反的結(jié)論。同樣，Kothapalli等[16]發(fā)現(xiàn)在大顆粒淋巴細(xì)胞白血病中Cys C基因表達(dá)下調(diào)。

圖1 Cat B(A:食管癌；B：癌旁)和Cys C(C:食管癌；D：癌旁)在不同食管組織中的表達(dá)(S-P，×400)

組別nCatB-±+++CysC-±+++腫瘤分化程度 高分化1153212432 中分化251247216126 低分化20538403107腫瘤侵襲程度 T1+T224123721896 T3+T43210710525169淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無2074632765 有36156114161910

注：Cat B：腫瘤分化程度χ2=3.927,P=0.140；腫瘤侵襲程度Z=1.022,P=0.307；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Z=4.191,P<0.001。Cys C：腫瘤分化程度χ2=4.636,P=0.098; 腫瘤侵襲程度Z=3.118,P=0.002；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Z=4.930,P<0.001

本研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中Cat B和Cys C蛋白及mRNA水平均較癌旁正常食管黏膜組織升高，并且食管癌組織中兩者的表達(dá)顯著正相關(guān)。Cys C表達(dá)水平的升高，可能是由于機(jī)體反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的結(jié)果，食管癌組織中Cat B表達(dá)增加，會(huì)反饋性引起Cys C表達(dá)的增多，而增加的Cys C抑制了Cat B的活性，以降低腫瘤細(xì)胞的浸潤侵襲能力。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，Cat B和Cys C的表達(dá)均與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Cys C的表達(dá)還與腫瘤侵襲程度有關(guān)，這提示Cat B和Cys C與食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制密切相關(guān)。

總之，Cat B 和Cys C在食管癌組織中均顯著高表達(dá)，可以作為食管癌早期診斷的分子標(biāo)志物之一。探索Cat B和Cys C對食管癌發(fā)生、發(fā)展的具體作用及機(jī)制，可以為食管癌分子靶向治療提供新的思路及方向。

圖2 Cat B(左)和Cys C(右)mRNA在不同食管組織中的表達(dá)

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Expressions of Cat B and Cys C in the Esophageal Carcinoma

YAN Yan1,ZHOU Kun2,YI Qiaoli1,FAN Qingxia1

(1.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China; 2.DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To investigate the expressions of Cathepsin B(Cat B) and Cystatin C(Cys C) gene in the esophageal carcinoma.Methods Fifty-six patients with esophageal carcinoma were randomly collected,and the Cat B and Cys C expressions of esophageal carcinoma and matched normal esophageal mucosal samples were were determined by immunohistochemistry and qRT-PCR.Results Compared with normal esophageal mucosal tissues,mRNA and protein levels of Cat B and Cys C in the esophageal carcinoma tissues were significantly increased (P<0.05).Cat B was positively related with Cys C in the esophageal carcinoma tissues(rs=0.970，P<0.05).The expressions of Cat B and Cys C were related with lymph node metastases and the expression of Cys C was related with degree of tumor invasion(P<0.05).Conclusion These results show that mRNA and protein levels of Cys C in esophageal carcinoma tissues were significantly increased.They are expected to be a molecular marker for the early diagnosis of esophageal carcinoma.Cat B and Cys C expression were high in the esophageal carcinoma,and their high expressions are related to tumor malignant degree,and Cat B and Cys C can be used as the early diagnostic and prognostic molecular markers of esophageal carcinoma.

Cat B; Cys C; esophageal carcinoma

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：81672424)；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號：201702010)

閆焱(1982-)，女，博士，主要從事食管癌的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：happyyy0721@163.com

樊青霞(1952-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: baihe3@tom.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.03.001

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2017)03-0185-04

2016-12-23)