劉通+黃權(quán)+鐘騰猛+林李生+黎竹寶

【摘要】 目的 對比早期胃癌患者與健康人血清代謝產(chǎn)物的差異，尋找潛在的與早期胃癌相關(guān)的小分子代謝標(biāo)志物。

方法 應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)對16例早期胃癌患者與20例健康對照者的血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測。采用主成分分析法（PCA）、偏最小二乘判別法（PLS-DA）和t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析早期胃癌實(shí)驗(yàn)組與健康對照組的差異代謝物，最后將找到的差異代謝物通過人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）檢索鑒定。

結(jié)果 與正常人相比，早期胃癌患者糖類、脂類等代謝可能存在異常，同時(shí)共篩選鑒定出9個(gè)對分類有顯著貢獻(xiàn)的代謝標(biāo)志物。

結(jié)論 基于HPLC-MS技術(shù)的血清代謝組學(xué)分析方法能夠有效區(qū)分早期胃癌與健康個(gè)體，對早期胃癌的診斷具有潛在的臨床價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 早期胃癌；代謝組學(xué)；代謝標(biāo)志物

【Abstract】 Objective To compare the difference of the serum metabolites of patients with early gastric cancer and healthy subjects，so as to search for potential small molecular markers associated with early gastric cancer.

Methods Serum samples from 16 patients with early gastric cancer and 20 healthy controls were examined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）.Principal component analysis （PCA），partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA） and t test were used to statistically analyze the differential metabolites of early gastric cancer experimental group and healthy control group.And the differential metabolites were identified by searching human metabolic database （HMDB）.

Results Compared with normal people，the metabolism of carbohydrate and lipid might be abnormal in early gastric cancer patients.At the same time，9 metabolic markers which have significant contribution to classification were screened out.

Conclusion Serum metabonomics analysis method based on HPLC-MS technology can distinguish early gastric cancer from healthy individuals，and has potential clinical value in the diagnosis of early gastric cancer.

【Key words】 early gastric cancer；metabolomics；biomarkers

胃癌作為我國常見的一種高發(fā)腫瘤，每年新增病例及死亡病例都居世界前列。其早期癥狀隱匿，很多患者在就診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)治療的最好時(shí)機(jī)。而其預(yù)后又與治療的時(shí)機(jī)密切相關(guān)，因此胃癌的早發(fā)現(xiàn)非常關(guān)鍵。胃癌是一種多基因參與，多步驟遺傳學(xué)改變的消化系統(tǒng)疾病，其基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后的修飾等各個(gè)環(huán)節(jié)都可能發(fā)生變異，因此用單個(gè)或數(shù)個(gè)生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測解決不了低敏感性和低特異性的問題。1999年，Nicholson等[1]提出了“代謝組學(xué)”（metabonomics）的概念，將其定義為“對新陳代謝過程中所有低分子量（<1000 D）代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量的研究，以反映生物體對外界刺激或基因修飾所發(fā)生的變化的科學(xué)”，它研究的主要對象是生命新陳代謝活動(dòng)的終末產(chǎn)物[2]。正常狀態(tài)下，體內(nèi)各代謝產(chǎn)物處于動(dòng)態(tài)平衡，在機(jī)體出現(xiàn)代謝障礙或者受到其他因素如腫瘤等疾病影響時(shí)，代謝產(chǎn)物的成分和濃度也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化[3]。所以通過代謝組學(xué)技術(shù)對生物體內(nèi)隨時(shí)間變化的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，便能將代謝產(chǎn)物的變化與病理生理過程中的生物學(xué)事件直接聯(lián)系起來。本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)對早期胃癌血清中小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，探討代謝組學(xué)方法在早期胃癌診斷中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

胃鏡和病理檢查證實(shí)的16例早期胃癌實(shí)驗(yàn)組，20例健康對照組。實(shí)驗(yàn)組平均年齡（63±8）歲，男性12例，女性4例。對照組平均年齡（61±5）歲，男性8例，女性12例。由于代謝產(chǎn)物受多因素的調(diào)節(jié)，為避免干擾，胃癌患者入選前未經(jīng)任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）本身具有代謝性疾病，如糖尿病、痛風(fēng)、高脂血癥等；（2）血液疾病；（3）懷孕或哺乳期女性；（4）過去2周曾發(fā)生重大的應(yīng)激反應(yīng)，如燒傷或者精神創(chuàng)傷等；（5）過去兩周服用特殊藥物如抗生素、激素、非甾體類抗炎藥；過去2周有任何急性疾病癥狀；（6）采血前采取過任何醫(yī)療措施。早期胃癌根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（UICC/AJCC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第7版）。實(shí)驗(yàn)組均為TNM ⅠA期。實(shí)驗(yàn)組胃鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)：早期胃癌無論有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，早期病變局限于黏膜及黏膜下層，常見于胃竇部、胃體部及小彎側(cè)。按具體形態(tài)分型可分Ⅰ型隆起型（息肉型）、Ⅱ型淺表型（胃炎型）和Ⅲ型凹陷型（潰瘍型）三型。Ⅰ型主要表現(xiàn)為黏膜局部突起，突向胃腔，一般表面較粗糙帶蒂，有的呈乳頭狀或結(jié)節(jié)狀，表面常伴有糜爛。Ⅱ型淺表型邊界常不整齊，邊界不清，局部黏膜稍顯粗糙，略隆起或凹陷，表面顏色常變淡或發(fā)紅，可伴糜爛。Ⅲ型常見有較明顯的潰瘍，多超過黏膜層。實(shí)驗(yàn)組病理診斷標(biāo)準(zhǔn)為早期胃癌：癌組織局限于黏膜及黏膜下層。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜儀：Agilent 1200（G6410A），美國Agilent公司；超純水系統(tǒng)：Milli-Q，美國Millipor公司；自動(dòng)液體進(jìn)樣器：美國Agilent公司Agilen；甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇，美國Sigma公司。

1.3 樣本采集

采集入選人員空腹血標(biāo)本3 ml于含有肝素鈉的采血管中靜止1 h凝固分層，離心（3000 rpm 10 min），取上清液分裝至離心管，保存于-80℃冰箱待用。

1.4 樣本預(yù)處理

將低溫保存的血清樣本放置室溫解凍混勻，取100 μL血清放入離心管，加入300 μL乙腈搖晃混勻15 s，室溫靜置15 min，后在4℃，10 000 rpm離心10 min，取上清液200 μL，在常溫下干燥60～90 min，再取上清液用50 μL乙腈/水溶劑（3∶1）復(fù)溶，取上清液過0.22 μm水相膜，然后上清液加入100 μL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸有獨(dú)立的色譜峰，不會(huì)干擾正常樣本檢測，常被用來作為內(nèi)標(biāo)）后與超純水室溫放置1 h后上樣分析。

1.5 質(zhì)控（quality control，QC）

為了觀察試驗(yàn)方法的穩(wěn)定性，在每6個(gè)血清后分別都加入一個(gè)QC樣本。QC樣本制備：室溫?fù)u勻解凍的血、尿樣本取5 μL，加入甲醇和乙腈1∶1混合液再加入L-2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)。其余處理同上文。

1.6 HPLC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱選用Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）。柱溫維持在45℃，流動(dòng)相為：A為含水甲酸，B為乙腈、甲醇、異丙醇、甲酸混合溶液。單次進(jìn)樣5 μL，流液速度：1.0 ml/min。質(zhì)譜條件：采用ESI，正離子模式下：毛細(xì)管電壓4 KV，電子能量3 eV，延時(shí)溶液5 min，離子源溫度115℃，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速9 L/min，參比荷質(zhì)比（m/z）80～900，質(zhì)量全掃描范圍100～1000，掃描時(shí)間0.03 s。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

（1）將液相色譜質(zhì)譜儀獲得的原始數(shù)據(jù)通過Analyst 1.5.1軟件（AB Sciex 公司）采集，得到兩組樣本的總離子流圖（TIC）。同時(shí)通過軟件獲得保留時(shí)間和精確質(zhì)核比組成的樣本名稱、譜峰索引和峰強(qiáng)度面積。然后將原始數(shù)據(jù)使用AB Sciex公司提供的MarkerView軟件進(jìn)行歸一化得到相對濃度，其次繼續(xù)標(biāo)度化、濾噪和峰對齊等處理，得出的數(shù)據(jù)再進(jìn)一步行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。（2）通過MarkerView軟件采用主成分分析（PCA）方法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分類，同時(shí)繪制樣本分布得分圖（Score plot）。得分圖上一個(gè)樣品代表一個(gè)點(diǎn)，每一個(gè)點(diǎn)的位置僅與該樣本的小分子代謝產(chǎn)物的成分及濃度大小有關(guān)，一般相似病理生理的樣本組成成分類似，所以在得分圖上會(huì)相對靠近，一定程度上會(huì)有集中的趨勢。樣本之間的離散程度越大，距離越遠(yuǎn)，說明樣本間狀態(tài)差異越大。我們選取的樣本來自于兩個(gè)不同病理生理狀態(tài)的群體，猜測同一來源樣本在得分圖上會(huì)相對靠近，反之相對遠(yuǎn)離。通過此來觀察兩組的離散和聚集情況。然后應(yīng)用有監(jiān)督模式識(shí)別方法偏最小二乘判別法（PLS-DA）制圖，進(jìn)一步分析得到能區(qū)分組間差異的代謝物即找出聯(lián)合變量重要性因子值（variable importance in the projection，VIP）大于1的代謝產(chǎn)物，再對這些產(chǎn)物進(jìn)行t檢驗(yàn)，找到有差異的代謝物（P<0.05）。最后將找到的差異代謝物通過人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）檢索鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 HPLC-MS檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對照組的血清樣本通過檢測和Analyst采集獲得總離子流圖（TIC）。通過整體的總離子流圖可以直接觀察出兩組樣本代謝產(chǎn)物的差異，箭頭所示在同一保留時(shí)間樣本之間峰度值的差異。見圖1。

2.2 PCA與t檢驗(yàn)

無監(jiān)督模式PCA是將多個(gè)有聯(lián)系的變量變?yōu)樯贁?shù)幾個(gè)綜合變量，建立盡可能少的獨(dú)立新變量來反映原數(shù)據(jù)的大量信息，從而達(dá)到降維的目的[4]。從PCA的得分圖（圖2-A）可知實(shí)驗(yàn)組和對照組個(gè)別存在交叉，但總體分離趨勢明顯。模型解釋了73%（R2X 0.73）的原始數(shù)據(jù)，然后應(yīng)用有監(jiān)督方法PLS-DA對數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，圖中（圖2-B）結(jié)果相對PCA分類明顯改善，兩組間完全分離，98.2%的樣本符合模型判別（R2Y 0.982），并且模型預(yù)測能力達(dá)到91.4%（Q2Y 0.914），表明本模型穩(wěn)定性及預(yù)測性均較可。

2.3 早期胃癌潛在標(biāo)志物鑒定

結(jié)合PLS-DA中的VIP值與t檢驗(yàn)結(jié)果篩選出組間差異代謝物，通過人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）檢索鑒定，得到9種在兩組間中存差異的代謝物，其相對濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討 論

目前發(fā)現(xiàn)的胃癌血清腫瘤標(biāo)志物主要包括PG、TK、FAS、CA724、CEA、CA199、MG7-Ag、幽門螺桿菌抗體、腫瘤自身抗體、胃癌相關(guān)血清蛋白、激素類、細(xì)胞因子[5]等。目前這些指標(biāo)在早期胃癌的診斷中都沒有足夠的特異性和靈敏度，因此尋找新的腫瘤標(biāo)志物是目前亟待解決的難題。

代謝組學(xué)作為“后基因組學(xué)”領(lǐng)域的一門新興技術(shù)，隨著分析手段的進(jìn)步，其高通量、高敏感度的優(yōu)勢逐漸開始在腫瘤標(biāo)志物的尋找方面具備獨(dú)特的優(yōu)勢和廣闊的前景。本研究通過應(yīng)用HPLC-MS技術(shù)，對早期胃癌實(shí)驗(yàn)組和健康對照組血清代謝圖譜進(jìn)行分析，通過PCA、PLS-DA、t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩組樣本間代謝圖譜出現(xiàn)明顯分離趨勢，提示早期胃癌相較于正常人體內(nèi)小分子代謝發(fā)生明顯異常，這為我們今后擴(kuò)大樣本數(shù)量，進(jìn)一步驗(yàn)證代謝組學(xué)在早期胃癌診斷及分析其可能存在的發(fā)生機(jī)制打下了良好基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中篩選出了9種差異性的代謝產(chǎn)物，包括二氫膽固醇、膽固醇、酪氨酸、乳酸、酪胺、3-羥基丙酸、丙酮酸、丙氨酸、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）。其中除丙酮酸、丙氨酸、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）在早期胃癌中降低外，其余均升高。這些物質(zhì)提示在胃癌發(fā)生的早期，機(jī)體已經(jīng)發(fā)生了一系列的紊亂。比如糖代謝途徑“Warburg effect[6]”效應(yīng)存在，丙氨酸在肝臟中通過聯(lián)合脫氨基作用生成丙酮酸，經(jīng)糖異生作用轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在腫瘤發(fā)生階段，三羧酸循環(huán)代謝異常，無氧酵解增強(qiáng)，乳酸便會(huì)增多，這又導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)不足，糖消耗量增多，糖異生便相應(yīng)增加，丙酮酸作為生糖氨基酸的量也隨著減少[7]，這在肺癌中也有報(bào)道[8]。脂類代謝異常在本實(shí)驗(yàn)中主要涉及溶血磷脂酰膽堿和膽固醇，前者降低的原因可能與它是參與腫瘤細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞膜組成的重要物質(zhì)相關(guān)，后者考慮是當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤壞死因子（TNF-α）表達(dá)增多會(huì)抑制載脂蛋白的活化酶，從而影響到與膽固醇的結(jié)合，最終導(dǎo)致血液中膽固醇升高[9]。同時(shí)它的升高也可能與脂肪動(dòng)員增強(qiáng)密切相關(guān)[10]。另外二氫膽固醇和3-羥基丙酸在早期胃癌患者體內(nèi)的異常變化也得到了其他研究人員的證實(shí)[11～12]。而酪氨酸、酪胺在早期胃癌組的異常蓄積尚未見有報(bào)道，但酪氨酸在其他腫瘤如乙肝所致肝癌的患者血液中明顯增加[13]。盡管這些物質(zhì)在早期胃癌發(fā)生過程中的具體機(jī)制尚未完全明確，但相信隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，數(shù)據(jù)庫的完善，實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量的增加，早期胃癌的神秘面紗終將有一天會(huì)被我們揭開。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2017-03-18 修回日期：2017-05-09）

（編輯：潘明志）