吳 弟， 余麗麗， 羅曉民

(1.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院， 陜西 西安 710021)

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N-取代馬來酰亞胺光敏感納米粒子的制備及其藥物可控釋放性能研究

吳 弟1， 余麗麗2， 羅曉民1

(1.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院， 陜西 西安 710021)

以甲基丙烯酸甲酯(MMA)和呋喃保護(hù)的N-羥乙基馬來酰亞胺的甲基丙烯酸酯(D)為單體，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，含有鄰硝基芐基的鄰硝基苯乙二醇二甲基丙烯酸甲酯(CL)為光敏感交聯(lián)劑，通過微乳聚合的方法制備了一種新型光敏感納米粒子.并以尼羅紅(NR)作為模型分子，研究了納米粒子對脂溶性藥物的包載和釋放性能.

鄰硝基芐基； N-取代馬來酰亞胺； 光敏感； 微乳聚合

0 引言

環(huán)境敏感型納米粒子是目前藥物載體材料的研究熱點(diǎn)之一.根據(jù)環(huán)境刺激的類別差異，可分為溫敏感型[1]、pH敏感型[2]、光敏感型[3]、氧化還原敏感型[4]等各類敏感型納米粒子.與pH和氧化還原等化學(xué)刺激相比，光刺激是一種潔凈的外部物理刺激，可控性較強(qiáng)，無需體內(nèi)化學(xué)環(huán)境的變化，毒副作用更小[5].光敏感納米藥物載體通常是通過在結(jié)構(gòu)中引入光敏感的化學(xué)基團(tuán)(如偶氮苯、螺吡喃、香豆素等[6])，用波長≤360 nm的高強(qiáng)度的紫外光(6～20 mW/cm-2)[7]刺激來實現(xiàn)其光響應(yīng)，但存在生物體不能耐受的問題，限制了其實際應(yīng)用.因此，亟需開發(fā)低毒、高效、高響應(yīng)波長的光敏感藥物載體.

據(jù)文獻(xiàn)報道，鄰硝基芐酯(ONB)及其衍生物類光敏感性基團(tuán)對低強(qiáng)度的光(365 nm、490 nm、719 nm)刺激具有一定的響應(yīng)性能力[8]，并且此類光敏感性基團(tuán)種類較多，合成簡便，光解效果更佳，因而在光敏感藥物載體方面具有更高的研究價值[9].同時，臨床研究表明，在載體表面引入主動靶向性基團(tuán)將更有利于藥物的定位輸送.由于馬來酰亞胺在水相環(huán)境中可與巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)[10,11]，可作為藥物載體中含巰基的主動靶向性基團(tuán)的連接點(diǎn)[12]，為后續(xù)光敏感藥物載體的進(jìn)一步功能化改性提供反應(yīng)點(diǎn)位.但是由于馬來酰亞胺本身可參與自由基聚合[10]，因此關(guān)于自由基聚合構(gòu)建的含有馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)的納米粒子報道較少.

為此，本實驗合成了呋喃保護(hù)的馬來酰亞胺單體，并將其與ONB類光敏交聯(lián)劑進(jìn)行微乳聚合，首次獲得了含有馬來酰亞胺單體的光敏感納米粒子，并以尼羅紅(NR)為模型分子分析該粒子對于脂溶性分子的低強(qiáng)度紫外光(5 000μW/cm2)的刺激響應(yīng)性能.為光敏感靶向性藥物載體的設(shè)計開發(fā)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù).

1 實驗部分

1.1 主要試劑

鄰硝基苯乙酮,化學(xué)純，廣東翁江化學(xué)試劑；甲基丙烯酰氯,97%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)；氧雜酸酐,生化級，上海阿拉丁生化科技；乙醇胺,分析純，上海阿拉丁生化科技；甲基丙烯酸甲酯(MMA),分析純，上海晶純生化科技.

1.2 制備方法

1.2.1 光敏感交聯(lián)劑鄰硝基苯乙二醇二甲基丙烯酸甲酯(CL)的合成

鄰硝基苯乙二醇二甲基丙烯酸甲酯(CL)的合成路線如圖1所示.具體的制備方法、表征及性能檢測詳見參考文獻(xiàn)[13].

圖1 CL的合成路線

1.2.2 單體D的合成

呋喃保護(hù)的N-羥乙基馬來酰亞胺(單體B)和呋喃保護(hù)的N-羥乙基馬來酰亞胺的甲基丙烯酸酯(單體D)的合成路線如圖2所示.取氧雜酸酐(單體A)1.0 g(6.0 mmoL)溶于30 mL甲醇中，制成溶液1；另取乙醇胺0.36 mL(6.0 mmoL)加入甲醇2 mL、三乙胺(TEA)0.8 mL(6.0 mmoL)，制成溶液2；然后將溶液2滴加到溶液1中，60 ℃攪拌回流3.5 h；冷卻至室溫，TLC檢測(展開劑二氯甲烷(DCM)∶甲醇∶冰乙酸=20∶1∶1)，無水Na2SO4干燥，濃縮后用適量的95%乙醇洗滌，干燥得到白色固體狀的單體B 0.889 g，產(chǎn)率為71 %.

取單體B 0.515 g(2.464 mmoL)于50 mL圓底燒瓶中，加入適量的四氫呋喃(THF)使其完全溶解，共沸除水，加入15 mL DCM使其完全溶解，冰浴(0 ℃)攪拌，再加入0.58 mL甲基丙烯酰氯和0.54 mL TEA，反應(yīng)2.5 h，TLC檢驗(展開劑乙酸乙酯(EA)∶石油醚(PE)=3∶4)，用40 mL飽和NaHCO3洗滌三次，無水Na2SO4干燥，濃縮，再以EA∶PE=3∶4為洗脫劑柱層析純化，得到目標(biāo)產(chǎn)物白色固體狀的單體D 0.533 g，產(chǎn)率為77 %.

圖2 單體B和單體D的合成路線

1.2.3 光敏感納米粒子的合成

光敏感納米粒子的合成路線如圖3所示.量取40μL甲基丙烯酸甲酯(MMA)于10 mL茄型瓶中，稱取10 mg單體D溶于0.5 mL DCM中加入上述反應(yīng)瓶中，再依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)w=5%的AIBN的DCM溶液10 uL、CL 2.5 mg、蒸餾水5 mL、十二烷基硫酸鈉(SDS)0.5 mg，超聲處理(1 200 W，2 s超聲，2 s間歇)3 min，轉(zhuǎn)移至厚壁耐壓瓶中通N25 min后升溫至80 ℃攪拌6 h.冷卻至室溫，敞口攪拌過夜，使DCM自然揮發(fā)，用水透析24 h(每2 h換一次透析液)后，最終將產(chǎn)物冷凍干燥，制得白色光敏感納米粒子.

圖3 光敏感納米粒子的合成路線

1.2.4 載NR光敏感納米粒子的合成

精確稱取NR 4 mg于10 mL容量瓶中，用THF溶解并定容至10 mL配制NR母液備用.量取50μL MMA于10 mL稱量瓶中，量取120μL NR母液溶于0.5 mL DCM中加入上述稱量瓶中，再依次加入w=5%的偶氮二異丁腈(AIBN)的DCM溶液10μL、CL 2.5 mg、蒸餾水5 mL、SDS 0.5 mg，超聲處理(1 200 W，2 s超聲，2 s間歇)3 min，轉(zhuǎn)移至厚壁耐壓瓶中通N25 min后升溫至80 ℃攪拌6 h，冷卻至室溫，打開瓶蓋，過夜，待DCM揮發(fā)完，透析冷凍干燥，制得包載NR的光敏感納米粒子.

1.3 檢測及表征

1.3.1 結(jié)構(gòu)表征

核磁共振氫譜(1H-NMR)：AVANCEⅢ 400MHz核磁共振儀，德國Bruker公司，溶劑為氘代氯仿(CDCl3)；紅外光譜(FT-IR)：TENSOR27，德國Bruker公司；場發(fā)射掃描電鏡(SEM)：S4800型，日本理學(xué)公司；紫外光源：B-100AP紫外燈(365 nm)，美國UVP公司.

1.3.2 載NR納米粒子的光敏感性能測試

用美國Perkin Elmer公司LS55熒光分光光度計測試樣品的熒光光譜.將制備好的載NR納米粒子取1 mL超聲10 min充分分散，先用紫外燈(365 nm)照射0 min、0.5 min 、1 min、 2 min、 4 min、 8 min、15 min后分別掃描三個樣品的熒光發(fā)射，其中激發(fā)波長為557 nm，狹縫值Ex=10、Em=6，波長范圍為580～700 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 單體D的結(jié)構(gòu)表征

單體D的1H-NMR譜見圖4所示.由圖4可知，δ=6.50處為2、3雙鍵上的2個H信號(為單峰)；δ=6.05、δ=5.54兩處單峰為10位置雙鍵上的氫信號，由于存在雙鍵的立體異構(gòu)，因此該處的峰出現(xiàn)在兩個不同的化學(xué)位移上；δ=5.24處為醚鍵連接的1，4兩個位置上的H信號；δ=4.26附近為8處H的信號，與反應(yīng)物相比該處的信號向低場移動明顯，證明了酯鍵的生成；δ=3.80附近為酰胺鍵連接的7處的H信號，該處與反應(yīng)物相比沒有顯著的變化；δ=2.85處為5、6兩個對稱位置的H信號；δ=1.88處出現(xiàn)了9位置的甲基信號.因此1H-NMR表征結(jié)果顯示得到的單體結(jié)構(gòu)符合預(yù)期.

圖4 單體D的1H-NMR譜圖

2.2 光敏感納米粒子的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 FT-IR分析

圖5為納米粒子的紅外譜圖.由圖5可知,3 446.2 cm-1處為D基團(tuán)的-NH的吸收峰，2 935.6 cm-1處為CL基團(tuán)和D基團(tuán)的-CH3吸收峰，1 728.1 cm-1為CL基團(tuán)和D基團(tuán)中羰基C=O鍵的吸收峰，1 576.1 cm-1處的吸收峰為NO2中N=O雙鍵的振動吸收區(qū)域，1 447.4 cm-1處是甲基的變形振動吸收峰，1 134.9 cm-1處是醚鍵C-O-C的吸收峰.

圖5 納米粒子的紅外光譜圖

圖6為不同光照時間下納米粒子的紅外圖譜.由圖6可知，在1 730.9 cm-1處為締合的羧基C=O雙鍵的吸收峰，隨光照時間的增加強(qiáng)度增大C=O雙鍵的強(qiáng)度增加，而且在983.1 cm-1處出現(xiàn)的新峰為羧基的-OH峰吸收佐證了羧基的存在，所以光照裂解形成了羧酸，在1 576.1 cm-1處的吸收峰為NO2中N=O雙鍵的振動吸收區(qū)域，吸收峰隨光照時間的增長而逐漸消失，可能是由于苯環(huán)上的NO2的裂解發(fā)生變化而引起的，1 454.1 cm-1為NO的紅外吸收區(qū)域，1 272.4 cm-1和1 339.2 cm-1兩個位置處出現(xiàn)新峰可以歸屬為芳香胺的C-N特征吸收峰，從而證明了苯環(huán)上的NO2在光照后生成NO.

圖6 納米粒子在紫外光照射下的紅外光譜圖

2.2.2 SEM形貌觀察

圖7為納米粒子光照前后的SEM圖.由圖7可知，該實驗獲得的納米粒子粒徑分布較為均勻，球形較為完整，但是存在著一些黏連的現(xiàn)象需要改善.光照后，納米粒子有部分結(jié)構(gòu)的坍塌，粒子之間的黏連現(xiàn)象更加顯著.

(a)光敏感納米粒子的光照前SEM圖

(b)光敏感納米粒子的光照后SEM圖圖7 光敏感納米粒子的SEM圖

2.3 光敏感納米粒子NR包載與釋放

圖8(a)、(b)和(c)分別為含CL 5%、15%和25%的載NR納米粒子隨光照時間的熒光圖譜.NR是一種脂溶性熒光分子，當(dāng)其被包載于粒子的核心時，體系顯示較強(qiáng)的熒光，而當(dāng)其被釋放進(jìn)出水相后，NR沉降出來，熒光強(qiáng)度快速下降.從圖8可以直觀地看出，光照可加快NR的釋放，相同光照時間對不同濃度CL的納米粒子影響不同.由此可見，該粒子可用于脂溶性藥物的包載與光控釋放.

(a)CL比例為5%的載NR納米粒子光照后熒光圖譜

(b)CL比例為15%的載NR納米粒子光照后熒光圖譜

(c)CL比例為25%的載NR納米粒子光照后熒光圖譜

(d)不同比例CL的納米粒子對應(yīng)的NR釋放比率圖8 不同比例CL的載NR納米粒子光照后熒光圖譜以及NR釋放比率

圖8(d)為不同交聯(lián)度的載NR納米粒子在光照過程中的NR釋放動力學(xué)曲線.由圖8(d)可知，在低強(qiáng)度UV(365 nm，5 000μW/cm2)照射下，NR被持續(xù)快速的釋放；照射后大約30 s內(nèi)，有大約30%～50%的NR被釋放，照射15 min后大約70%～90%的NR被釋放，表明這種納米粒子具有較高的光敏感性和釋放效率.

交聯(lián)劑是粒子藥物光控釋放能力的一個重要影響因素.當(dāng)交聯(lián)劑含量小于15%時，15 min的光照可引起80 %以上的藥物釋放，當(dāng)其交聯(lián)劑含量達(dá)到25%時，其15 min光控釋放效率達(dá)到90%以上.但是由于本實驗前期只對比了交聯(lián)劑為15%以下的樣品，因此選擇了交聯(lián)劑含量較少的樣品(5%)為主要研究對象，建議后期的實驗可重點(diǎn)考察高濃度交聯(lián)劑情況下粒子的各項性能.

3 結(jié)論

(1)實驗合成了呋喃保護(hù)的含馬來酰亞胺的單體D.

(2)通過微乳聚合的方法，首次合成了含有馬來酰亞胺基團(tuán)的光敏感型納米粒子藥物載體，為后期含巰基的功能性基團(tuán)的引入奠定了基礎(chǔ)，可實現(xiàn)光敏感納米粒子的功能多樣化.

(3)這種納米粒子對NR光控釋放性能的研究有效地證明了該納米粒子具有較高的光敏感性和釋放效率，并且可控性良好，對生物體傷害較低，可以實現(xiàn)藥物快速、高效、安全、按需釋放的目的，從而有效提高藥物的利用率.

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Study on synthesis and control release of N-substituted maleimide photosensitive nanoparticle

WU Di1, YU Li-li2, LUO Xiao-min1

(1.College of Bioresources Chemical and Materials Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.Department of Pharmacy, Xi′an Medical University, Xi′an 710021, China)

A novel type of photosensitive nanoparticles were prepared by a microemulsion polymerization process,using methyl methacrylate (MMA) and furan protected methacrylate N-hydroxyethyl maleimide (D) as monomers,2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN) as initiator,O-nitrophenyl ethylene glycol dimethacrylate (CL) containing O-nitrobenzyl as photosensitive cross-linker.Package load capacity and the light controlled release ability of this nanoparticles for liposoluble drugs were studied using Nile red (NR) as the model molecules.

O-nitrobenzyl; N-substituted maleimide; photo sensitive; microemulsion polymerization

2017-01-21

陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育計劃項目(16JF003)

吳 弟(1988-)，男，安徽滁州人，在讀碩士研究生，研究方向：光敏感納米藥物載體

2096-398X(2017)04-0016-05

O625.61

A