吳衛(wèi)賓，任志勇，宋君，張維彬，魏長月

（1.陽光融和醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 261000；2.中國人民解放軍第89醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 261021）

因外傷等各種原因致四肢長骨大段缺損較為常見，臨床上有較多的方法治療，而Ilizarov技術是由前蘇聯(lián)醫(yī)學專家Gavriil Ilizarov于1952年設計并初步應用于臨床。該技術的理念是在損傷肢體用鋼針貫穿固定骨骼的幾個平面，Ilizarov外固定器連接固定，但需較長的外固定時間，有骨質(zhì)疏松、針道感染等各種并發(fā)癥存在。而解決并發(fā)癥則需縮短外固定架的固定時間，然而牽張成骨區(qū)成骨質(zhì)量必須盡早接近或達到正常就顯得尤為重要。近年來組織工程技術的迅猛發(fā)展，IGF-1在成骨于骨生長中起到非常重要的骨代謝平衡調(diào)節(jié)，參與了整個生命周期[1,2]。Johansson等[3]發(fā)現(xiàn)IGF-1既可增加成骨細胞的合成、分泌，又可加強破骨細胞的功能，但對成骨細胞作用更強，使骨質(zhì)增多，骨密度增加。任志勇等[4]在實驗中設計兔脛骨模型牽張成骨應用骨形態(tài)蛋白2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞證明了有促進骨形成及提高骨質(zhì)量作用。因此，我們通過分別將兔脛骨干骺端截骨，應用Ilizarov技術制作兔脛骨牽張成骨模型，在固定期內(nèi)第2天實驗組分別注入IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞于兔脛骨牽張延長區(qū)間隙內(nèi)，驗證IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植是否有促進對兔脛骨牽張成骨骨形成質(zhì)量的作用，并為臨床提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康新西蘭白兔48只，體重（2.5±0.2）kg，（9±1）周齡，雄性，由中國人民解放軍第89醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組

健康新西蘭白兔隨機分三組，每組16只，A組為實驗組：固定期第2天于牽張成骨區(qū)間隙內(nèi)注入IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞200μL。B組為對照組：于牽張成骨區(qū)間隙內(nèi)注入相同濃度200μL自體骨髓間充質(zhì)干細胞。C組為空白組：牽張成骨區(qū)間隙內(nèi)不注入任何物質(zhì)。

1.2.2 兔自體骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)

隨機取16只新西蘭白兔并依次標號1-16號，用5 mL注射器，取稀釋的肝素(1×104U/L)1 mL，肌肉注射。消毒后在兔股骨大粗隆頂點用實驗骨髓穿刺針抽取股骨骨髓4 mL，直接加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL中，置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度為37℃。3 d后更換一次，半量，此后每2天換液1次，方法同上。80%細胞鋪滿瓶底時，完全去掉上清液。沖洗：用PBS沖洗1遍后，加入0.25%胰蛋白酶消化2 min等待細胞變圓后，再加含血清DMEM液終止消化，吹打細胞，將兔自體骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)傳代至第P3代細胞，觀察細胞生長狀態(tài)良好。

1.2.3 真核質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染兔自體骨髓間充質(zhì)干細胞

利用重組大腸桿菌擴增并提取足夠數(shù)量空載質(zhì)粒、重組質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)染48 h后的兔骨髓間充質(zhì)干細胞FITC標記后在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IGF-1后的骨髓間充質(zhì)干細胞在熒光鏡下呈現(xiàn)綠色，而未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組未見熒光反應（圖 1 ，2）。

圖1 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-IGF-1（FITC標記×20）

圖2未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（FITC標記×20）

1.2.4 動物模型的制作

無菌條件下進行，肌注氯胺酮麻醉。沿兔左脛前內(nèi)側(cè)縱行切開中上1/3皮膚及皮下組織，鈍性分離脛前肌，暴露脛骨，在脛骨粗隆下約1.0 cm水平處截骨，分別在截骨面上下各0.5～1.0 cm處穿放兩組平行克氏針，將雙邊外固定架給予固定。截斷腓骨，縫合、包扎。術前、術中及術后青霉素肌肉注射預防感染。術后1周開始延長遠端穿骨模塊，每天牽張1.0 mm，分2次進行，牽張長度共1.0cm。固定期第2天，將相應編號IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞200 uL注入兔脛骨模型A組的牽張延長間隙內(nèi)；B組在牽張延長間隙給予注入相應編號相同濃度的自體骨髓間充質(zhì)干細胞；C組不予任何物質(zhì)注入。

1.3 觀察指標

1.3.1 影像學觀察

各組分別在固定期的第2周末，第6周末行兔左側(cè)脛骨模型全長X線透視，觀察牽張成骨延長區(qū)的成骨情況。

1.3.2 HE染色觀察

固定期第2，6周末在牽張成骨區(qū)內(nèi)取材，HE染色，切成50 um厚切片，光鏡下觀察組織學變化。

1.3.3 骨密度測定

于第3個月末取各組6只動物標本，用Hologic QDR-2000雙能X線骨密度儀(中國人民解放軍第89醫(yī)院影像科)測定骨密度。

1.3.4 結構力學實驗

第3個月末取各組6只動物標本，用CSS-4000萬能材料測試儀(中國人民解放軍第89醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所生物力學實驗室提供）行承受負荷強度、結構剛度、能量吸收結構生物力學測定。

2 結果

2.1 影像學檢查

固定期第2周末：X線片示三組牽張成骨兔脛骨模型正位片上，對位對線良好。三組延長區(qū)均可見低密度骨痂形成影像，骨痂密度A組略高于B組及C組（圖3）。

圖3 固定期第2周末X線表現(xiàn)

圖4 固定期第6周末X線表現(xiàn)

圖5 固定期第2周末HE染色（HE染色×200）

圖6 固定期第6周末HE染色（HE染色×100）

固定期第6周末：X線片示三組牽張成骨兔脛骨模型正位片上，對位對線良好。牽張成骨延長區(qū)三組新骨形成的數(shù)量及骨密度明顯增加，填充于整個牽張成骨延長區(qū)，骨痂影似由延長區(qū)間隙的兩端向中央生長，兩端有骨皮質(zhì)征象。延長區(qū)可見少量新骨影，呈片狀及條索狀排列。在X線片上顯示A組較B組及C組亮度高（圖4）。

2.2 HE染色觀察

固定期第2周末：顯示A組有少量纖維軟骨骨痂形成，B組及C組無纖維軟骨骨痂形成，炎性細胞及破骨細胞均減少（圖5）。

固定期第6周末：三組均有成熟骨基質(zhì)及骨小梁，但A組較B組及C組骨細胞增生活躍，軟骨肥厚帶增大，成骨細胞明顯可見密度增加、骨細胞肥大、鈣鹽沉積均勻，軟骨骨痂已向骨性骨痂轉(zhuǎn)變（圖6）。

2.3 骨密度測定

牽張成骨固定期3個月后各組隨機取6只實驗動物標本，Hologic QDR--2000雙能X線骨密度儀測定骨密度，用SPSS17.0統(tǒng)計程序在電子計算機上對實驗結果進行統(tǒng)計學分析，A組骨密度相對值（%）顯著高于B組與C組P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。B組與C組對比P＞0.05無統(tǒng)計學意義。骨密度值由高到低順序排列為：A組＞B組＞C組(表1)。說明胰島素樣生長因子1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞在兔脛骨牽張成骨實驗中可以促進骨生成。

2.4 生物力學測試

牽張成骨固定期3個月后各組取6只實驗動物標本行骨密度測定，使用CSS-4000萬能材料測試儀行生物力學測定。測定承受負荷強度、結構剛度、能量吸收各項指標，用SPSS 17.0統(tǒng)計程序行統(tǒng)計分析，分析實驗數(shù)據(jù)結果示：A組優(yōu)于B組和C組P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。B組與C組對比，P＞0.05無統(tǒng)計學意義。A組載荷強度最大(表2)。生物力學測試數(shù)值由高到低順序排列為：A組＞B組＞C組。說明IGF-1轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞在兔脛骨牽張成骨實驗中可以促進骨生成的質(zhì)量。

表1 骨密度測試結果(±s)

表1 骨密度測試結果(±s)

Group n BMD相對值（%）A組 6 47.9±23.1 B組 6 28.9±21.2 C組 6 26.8±22.3

表2 結構生物力學差數(shù)(±s)

表2 結構生物力學差數(shù)(±s)

Group n 最大負荷（N） 結構剛度（N·mm-1） 能量吸收（N·mm）A 組 6 187.35±11.68 207.66±35.73 209.73±26.51 B 組 6 173.87±21.54 189.17±38.34 170.66±29.31 C 組 6 169.97±29.34 185.82±40.53 169.75±20.67

3 討論

1905年意大利學者Codivila曾報道骨延長術；Ilizarov研究發(fā)現(xiàn)了牽張應力對組織生長再生的刺激作用，即牽張再生規(guī)律。Hamdy等[5]發(fā)現(xiàn)延長區(qū)出現(xiàn)牽引縱軸方向排列的膠原纖維和骨小梁，鈣化從兩端逐漸向中心。Cope等[6]的實驗也發(fā)現(xiàn)兩端向延長區(qū)中心逐漸鈣化，纖維組織和新生的骨小梁也逐漸增多，在延長后的第42天左右，則可見相對成熟的再生骨組織。Aronson等[7]研究觀察肢體延長區(qū)的細胞增殖現(xiàn)象，實驗中利用增殖細胞核抗原（PCNA）發(fā)現(xiàn)骨延長區(qū)增殖細胞呈區(qū)域分布，細胞的增殖與牽拉作用有關。Ilizarov外固定器連接固定，用于創(chuàng)傷及矯形方面如骨折、骨缺損、肢體延長、關節(jié)問題等。牽張成骨過程中成骨區(qū)在牽張期與固定早期骨質(zhì)脆弱，使該項技術需較長的外固定時間，然而有骨質(zhì)疏松、針道感染等各種并發(fā)癥存在。這些存在的問題一直讓我們探究。

IGF-1具有內(nèi)分泌和旁分泌特性的單鏈多肽因子，幾乎參與體內(nèi)每個器官的生長和功能[8-10]。在青春期和成年期IGF-1骨骼發(fā)育和成熟方面都起到重要作用，分別參與長骨生長、骨成熟、鈣質(zhì)在骨骼中的沉積和保持骨質(zhì)密度[11,12]的過程。在出生后及整個青春期，IGF-1和生長激素兩個因子對長骨的發(fā)育成熟都起著至關重要的作用[13，14]，IGF-1促進骨基質(zhì)的合成和礦化是多樣性的，可以通過不依賴促有絲分裂的途徑，影響骨代謝。IGFs還可以顯著增加骨吸收與骨形成的偶聯(lián)作用。鑒于IGF在成骨中的重要作用，科學研究人員將外源性生長因子應用于牽張成骨或骨折愈合區(qū)，從而加速骨創(chuàng)傷修復愈合過程，但由于外源性生長因子半衰期短，加之提取困難，價格昂貴等限制性因素的存在，應用效果不盡人意。自體骨髓間充質(zhì)干細胞不具有免疫原性，且具有取材創(chuàng)傷小、儲備多、易培養(yǎng)等優(yōu)點，經(jīng)IGF-1基因介導后植入牽張成骨區(qū)后可很好地存活增殖，并持續(xù)分泌IGF-1，可以很好地避免外源性生長因子應用的限制因素。應用符合Ilizarov骨牽張技術理念外固定架固定，在固定期內(nèi)第2天于牽張間隙內(nèi)注入IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞，驗證IGF-1基因介導的自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對兔脛骨牽張成骨骨形成質(zhì)量是否有促進作用未見文獻相關報道。

成骨質(zhì)量與多方面有密切關系，非介入的影像檢查是常用的臨床檢測手段，臨床常據(jù)此評估骨愈合的質(zhì)量，決定何時可以安全地拆除外固定器，目前常規(guī)的X線片還是最經(jīng)濟、有效的方法。我們于固定期的第2周末，第6周末對各組實驗動物分別行牽張成骨區(qū)X線攝片。在X線片上顯示實驗組明顯較對照組及空白組亮度高。我們同時在固定期的第2周末及第6周末將牽張成骨區(qū)骨組織作了HE染色觀察。除此之外我們還在本實驗中行骨密度及生物力學測定，實驗組均優(yōu)于對照組及空白組。因此我們推斷經(jīng)IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞通過分泌IGF-1對牽張區(qū)成骨質(zhì)量有明顯的促進作用。總之，本實驗將經(jīng)IGF-1基因轉(zhuǎn)染的自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植到牽張成骨區(qū)，通過干細胞的增殖分泌IGF1促進牽張成骨區(qū)成骨質(zhì)量。但IGF-1相互作用復雜且與多環(huán)節(jié)相關，目前還需我們進一步實驗研究。

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