李 力, 羅曉星

(解放軍第458醫(yī)院, 1. 檢驗(yàn)科; 2. 干部病房, 廣東 廣州, 510062)

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類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中miRNA表達(dá)譜研究及其臨床意義

李 力1, 羅曉星2

(解放軍第458醫(yī)院, 1. 檢驗(yàn)科; 2. 干部病房, 廣東 廣州, 510062)

目的 檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者與健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液中miRNA表達(dá)譜差異及臨床意義。方法 應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)3例RA患者和3例正常人關(guān)節(jié)液中miRNAs表達(dá)情況，篩選出表達(dá)差異顯著的miRNAs, 并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證。進(jìn)一步研究候選miRNA與RA臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果 RA患者關(guān)節(jié)液miRNA表達(dá)譜中23個(gè)miRNA較健康對(duì)照者發(fā)生顯著改變。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與芯片結(jié)果相符。RA患者與健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液中miR-146a的表達(dá)差異最為顯著。Pearson相關(guān)分析顯示, RA患者關(guān)節(jié)液中miR-146a的表達(dá)與類風(fēng)濕因子(RF)和DAS28評(píng)分呈正相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示, miR-146a曲線下面積(AUC)為0.71, 關(guān)節(jié)液miR-146a預(yù)測(cè)RA的靈敏度為85.29%, 特異度為61.54%。結(jié)論 RA患者關(guān)節(jié)液與健康人關(guān)節(jié)液存在表達(dá)差異顯著的miRNAs。miR-146a在RA患者關(guān)節(jié)液中表達(dá)顯著升高，其水平與RA的臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)存在顯著相關(guān)性。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎; miRNA芯片; 關(guān)節(jié)液; miR-146a

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)、滑膜的慢性炎癥以及后期關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞為主要特點(diǎn)的全身性自身免疫性疾病[1]。RA會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和活動(dòng)受限，最終導(dǎo)致病變關(guān)節(jié)功能障礙甚至功能喪失。RA病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，也缺乏療效確切的治療手段。MicroRNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的一類內(nèi)源性的、非編碼的單鏈小分子RNA。miRNA具有調(diào)控多個(gè)上游基因表達(dá)和下游蛋白翻譯的能力，具有調(diào)控包括惡性腫瘤形成、免疫炎性反應(yīng)等病理過(guò)程的能力[2]。大量的研究[3-4]顯示，miRNAs在RA發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制中起著非常重要的作用。本研究通過(guò)miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)RA患者與健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液中miRNA表達(dá)譜差異，分析其與RA臨床指標(biāo)的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

miRNA芯片檢測(cè)對(duì)象為解放軍第458醫(yī)院接受治療的3例臨床確診的RA患者和3例健康對(duì)照者。6例研究對(duì)象均為女性，年齡40～57歲。另選擇60例臨床確診的RA患者和30例健康對(duì)照者作為研究對(duì)象，進(jìn)行RA早期診斷標(biāo)志物miRNA的篩選以及與臨床病理特征關(guān)系的研究。60例RA患者中男15例，女45例，年齡38～58歲，平均(46.9±11.5)歲; 患病時(shí)間(4.2±2.7)年。所有入選RA患者均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除因其他疾病而引起的關(guān)節(jié)炎，且檢查前1周均未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素或非甾體類抗炎藥物。本研究受試者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 關(guān)節(jié)液標(biāo)本收集：患者取平臥位，膝關(guān)節(jié)局部消毒麻醉后，取髕上外側(cè)入路行膝關(guān)節(jié)腔穿刺，注射器抽取關(guān)節(jié)液約2 mL。室溫下靜置1 h, 上離心機(jī)2 000 r/min離心15 min, 取上清-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.2 miRNA芯片檢測(cè): ① 總RNA提?。翰捎肨rizol試劑對(duì)關(guān)節(jié)液總RNA進(jìn)行提取。經(jīng)過(guò)RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后, RNA電泳檢測(cè)提取RNA分子的完整性, Nanodrop ?ND-1000測(cè)定提取RNA的濃度。使用Nanodrop測(cè)定RNA 在分光光度計(jì)260、280和230 nm的吸收值，以計(jì)算濃度并評(píng)估純度。用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。② 制備熒光標(biāo)記探針：采用miRCURYTMArray Power 標(biāo)記試劑盒，將Hy3TM熒光基團(tuán)標(biāo)記miRNA制備熒光標(biāo)記探針。③ miRNA芯片雜交、芯片掃描和數(shù)據(jù)分析：將標(biāo)記好的探針和miRCURYTM芯片放入PhalanxTM的熱收縮雜交袋進(jìn)行雜交反應(yīng)。使用GenePix 4000B芯片對(duì)芯片進(jìn)行原始圖像掃描，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存。芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GenePix pro V6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)聚類分析，計(jì)算兩種檢測(cè)信號(hào)的比值(1og2)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證：基于芯片結(jié)果，對(duì)miRNA Foldchange值改變≥2的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。miRNA及U6引物序列購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。關(guān)節(jié)液總RNA提取方法步驟同上。逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)按照miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟構(gòu)建10 μL反應(yīng)體系: RNA 3 μL, 1×mirVana RT Primer 1 μL, Array script Enzyme Mix 0.4 μL, mirVana RT Buffer(5×) 2 μL, 加RNase-free water至總體積10 μL。反應(yīng)條件: 37 ℃, 15 min; 42 ℃, 50 min; 85 ℃, 5 min。按照miRNA SYBR Green PCR Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件: 95 ℃, 15 min; 95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s共40個(gè)PCR循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以U6 snRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析(CT值定義為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。采用2-ΔΔCT法對(duì)miR-146a表達(dá)相對(duì)值進(jìn)行分析。

1.2.4 RA臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè): DAS28評(píng)分[5]: ① 壓痛關(guān)節(jié)數(shù)：檢查雙側(cè)近端指間關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)計(jì)28個(gè)關(guān)節(jié)，得出關(guān)節(jié)觸痛或被動(dòng)活動(dòng)時(shí)的關(guān)節(jié)觸痛數(shù); ② 腫脹關(guān)節(jié)數(shù)：檢查上述28個(gè)關(guān)節(jié)腫脹與否，得出腫脹關(guān)節(jié)數(shù); ③ 紅細(xì)胞沉降率(ESR); ④ 最近7 d患者健康狀況或患者對(duì)RA病情活動(dòng)的總體評(píng)價(jià)：采用0～10 cm標(biāo)尺, 0表示病情無(wú)活動(dòng), 10表示病情極度活動(dòng)，中間部分表示RA不同程度的病情活動(dòng)，數(shù)字越大表示病情活動(dòng)性越強(qiáng)。DAS 28=0.56×壓痛關(guān)節(jié)數(shù)+0.28×腫脹關(guān)節(jié)數(shù)+0.70×Ln(ESR)×0.014×患者健康狀況評(píng)分。DAS 28范圍從0～10分，得分越高提示病情活動(dòng)性越高。類風(fēng)濕因子(RF)檢測(cè)：采用日立7100型全自動(dòng)生化分析儀，用免疫速率散射比濁法測(cè)定RA患者關(guān)節(jié)液RF濃度水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miRNA芯片結(jié)果

miRNA芯片檢測(cè)將表達(dá)差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為：改變倍數(shù)上調(diào)的或下調(diào)2倍以上(P<0.05)。結(jié)果如下: RA患者關(guān)節(jié)液miRNA表達(dá)譜中23個(gè)miRNA較健康對(duì)照者發(fā)生顯著改變(表達(dá)差異≥2倍)。其中表達(dá)上調(diào)≥2倍的miRNAs有16個(gè)，表達(dá)下調(diào)≥2倍的miRNAs有7個(gè)。見(jiàn)表1。

2.2 qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

以U6 snRNA為內(nèi)參，檢測(cè)miRNA芯片結(jié)果中表達(dá)差異顯著的23個(gè)miRNAs。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中RA患者和健康人關(guān)節(jié)液中該23個(gè)miRNAs表達(dá)水平差異情況與芯片的結(jié)果是一致的。

表1 RA患者和健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液中差異性表達(dá)的miRNAs

2.3 RA患者同健康對(duì)照組關(guān)節(jié)液miR-146a表達(dá)水平比較

作者選擇miRNA芯片結(jié)果中表達(dá)差異最顯著的miR-146a作為候選miRNA進(jìn)一步檢測(cè)。采用qRT-PCR檢測(cè)60例RA患者和30例健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液miR-146a表達(dá)水平。結(jié)果顯示：健康對(duì)照組人群關(guān)節(jié)液miR-146a相對(duì)表達(dá)水平為0.227±0.031, RA患者關(guān)節(jié)液miR-146a表達(dá)顯著升高，其相對(duì)表達(dá)水平為1.731±0.306, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 miR-146a與RA臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示, RA患者關(guān)節(jié)液miR-146 a表達(dá)水平與RF數(shù)值和DAS 28評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.472、0.587,P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-146a水平與左室重構(gòu)程度相關(guān)性

2.5 miR-146 a表達(dá)水平對(duì)RA的診斷效能

以miR-146a相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示, miR-146 a曲線下面積(AUC)為0.71(P<0.01); 關(guān)節(jié)液miR-146 a預(yù)測(cè)RA的靈敏度為85.29%, 特異度為61.54%。

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)miRNA開(kāi)展了廣泛和深入研究, miRNA在各種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用也越來(lái)越受到大家的重視。miRNA能通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的形式與靶基因的3′UTR部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者直接抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，最終在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的基因表達(dá)調(diào)控方式，即不同miRNA和靶基因之間能夠形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮精細(xì)調(diào)控功能基因表達(dá)的作用[6]。從miRNA與免疫系統(tǒng)的關(guān)系來(lái)看, miRNA在固有免疫和適應(yīng)性免疫以及炎癥因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。由于自身免疫功能的紊亂和細(xì)胞因子的分泌異常是導(dǎo)致RA發(fā)病的關(guān)鍵因素[7]。因此，針對(duì)miRNA與RA疾病之間的關(guān)系也開(kāi)展了一系列相關(guān)研究。2008年Stallczvk等[8]采用RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn), RA患者滑膜組織中miR-155和miR-146a的表達(dá)明顯高于正?；そM織。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), TNF-α、IL-1β、LPS、細(xì)菌脂蛋白和poly(I-C)等炎癥相關(guān)因子可誘導(dǎo)miR-155的產(chǎn)生。增強(qiáng)miR-155的表達(dá)則可以通過(guò)Toll樣受體配體(TLR)和細(xì)胞因子來(lái)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)的水平。鄭錫銘等[9]對(duì)比研究發(fā)現(xiàn), RA患者血清和關(guān)節(jié)液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106和miR-130的表達(dá)水平明顯高于普通骨關(guān)節(jié)炎和健康人。相關(guān)分析顯示，這些miRNAs與RA的活動(dòng)性指標(biāo)RF、ESR和CRP呈正相關(guān)。因此，對(duì)miRNA和RA之間關(guān)系的研究，不僅有助于明確RA發(fā)病機(jī)制，更可為RA的診斷和治療提供新的切入點(diǎn)。

隨著高靈敏性基因檢測(cè)芯片和PCR技術(shù)的應(yīng)用，目前在人體液(如血液、腹腔液、關(guān)節(jié)液、精液等)中能夠檢測(cè)到豐富并且穩(wěn)定表達(dá)的miRNAs[10]。此外，不同疾病相關(guān)體液中miRNAs表達(dá)譜和表達(dá)水平也不同。這種異常改變不僅與疾病病變情況密切相關(guān)，也具有很強(qiáng)的特異性。這些特性提示體液中的miRNAs可以作為潛在的疾病生物標(biāo)志物。關(guān)節(jié)液主要由關(guān)節(jié)滑囊和腱鞘的滑液膜分泌。臨床研究[11]證實(shí)，關(guān)節(jié)部位的疾患會(huì)導(dǎo)致分泌的關(guān)節(jié)液中出現(xiàn)病變代謝產(chǎn)物并潴留于關(guān)節(jié)腔。因此，關(guān)節(jié)液分子標(biāo)志物的檢測(cè)也是目前關(guān)節(jié)部位疾病診斷、療效檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估最敏感、最有效的指標(biāo)。本研究首先使用高靈敏的miRNA芯片來(lái)初步篩選出RA患者關(guān)節(jié)液中差異性表達(dá)的miRNAs。結(jié)果顯示與健康人相比，在RA患者關(guān)節(jié)液中發(fā)現(xiàn)23個(gè)明顯異常表達(dá)的miRNAs。其中表達(dá)上調(diào)≥2倍的miRNAs有16個(gè)，表達(dá)下調(diào)≥2倍的miRNAs有7個(gè)。其中表達(dá)差異最顯著的miR-146a, 其在RA患者關(guān)節(jié)液中的表達(dá)水平為健康人的10多倍。進(jìn)一步采用熒光定量PCR的方法對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示23個(gè)異常表達(dá)miRNAs在RA患者關(guān)節(jié)液中表達(dá)情況與芯片結(jié)果一致。

miR-146a是目前廣泛報(bào)道的與固有免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA[12]。有研究證實(shí), miR-146a能夠通過(guò)TLRs/NF-kB炎癥通路來(lái)調(diào)控炎癥反應(yīng)[13-14]。Nakasa等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)顯著升高。而體外采用TNF-α和IL-1β刺激能夠增強(qiáng)滑膜纖維細(xì)胞miR-146a的表達(dá)。提示miR-146a與RA炎癥反應(yīng)過(guò)程密切相關(guān)。本研究中我們選擇miR-146a作為候選miRNA進(jìn)一步檢測(cè)。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)60例RA患者和30例健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液miR-146a表達(dá)差異情況。RA患者關(guān)節(jié)液miR-146a表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組人群的。DAS 28評(píng)分和RF為目前臨床上常用的RA患者病情監(jiān)測(cè)評(píng)估指標(biāo)。DAS 28評(píng)分和RF數(shù)值越高，RA病情活動(dòng)度越大，病情越嚴(yán)重。Pearson相關(guān)分析顯示RA患者關(guān)節(jié)液miR-146 a表達(dá)水平與RF數(shù)值和DAS 28評(píng)分呈正相關(guān)。提示關(guān)節(jié)液miR-146 a水平能夠反映RA疾病活動(dòng)性，能夠作為RA疾病活動(dòng)性的標(biāo)志物。進(jìn)一步采用ROC曲線分析關(guān)節(jié)液miR-146 a水平對(duì)RA的診斷效能。結(jié)果顯示, miR-146 a曲線下面積(AUC)為0.71(P<0.01); 關(guān)節(jié)液miR-146 a預(yù)測(cè)RA的靈敏度為85.29%, 特異度為61.54%。

綜上所述，針對(duì)RA患者關(guān)節(jié)液中miRNAs的研究有助于了解RA的發(fā)病機(jī)制。通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)液中RA特異性miRNA檢測(cè)，有利于早期診斷RA, 并且對(duì)RA疾病嚴(yán)重程度和活動(dòng)性進(jìn)行評(píng)估。

[1] Carmona L, Cross M, Williams B, et al. Rheumatoid arthritis[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2010, 24(6): 733-745.

[2] Huang Y, Shen X J, Zou Q, et al. Biological functions of microRNAs[J]. Bioorg Khim, 2010, 36(6): 747-752.

[3] Mizoguchi F, Kohsaka H. Role of microRNA in rheumatoid arthritis[J]. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, 2012, 35(1): 69-74.

[4] Chatzikyriakidou A, Voulgari P V, Georgiou I, et al. miRNAs and related polymorphisms in rheumatoid arthritis susceptibility[J]. Autoimmun Rev, 2012, 11(9): 636-641.

[5] Langenegger T, Fransen J, Forster A, et al. Clinical quality management in rheumatoid arthritis[J]. Z Rheumatol, 2001, 60(5): 333-341.

[6] Wiklund E D, Kjems J, Clark S J. Epigenetic architecture and miRNA: reciprocal regulators[J]. Epigenomics, 2010, 2(6): 823-840.

[7] Balanescu S, Calmac L, Constantinescu D, et al. Systemic inflammation and early atheroma formation: are they related？[J]. Maedica (Buchar), 2010, 5(4): 292-301.

[8] Stanczyk J, Pedrioli D M, Brentano F, et al. Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and synovial tissue in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(4): 1001-1009.

[9] 鄭錫銘, 劉鑫, 周林林, 等. 6種miRNAs在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血及關(guān)節(jié)液中的表達(dá)分析[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2014(12): 1686-1691.

[10] Weber J A, Baxter D H, Zhang S, et al. The microRNA spectrum in 12 body fluids[J]. Clin Chem, 2010, 56(11): 1733-1741.

[11] Cuellar J M, Scuderi G J, Cuellar V G, et al. Diagnostic utility of cytokine biomarkers in the evaluation of acute knee pain[J]. J Bone Joint Surg Am, 2009, 91(10): 2313-2320.

[12] Xie W Q, Tan S Y, Wang X F. MiR-146a rs2910164 polymorphism increases risk of gastric cancer: a meta-analysis[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(41): 15440-15447.

[13] Saba R, Sorensen D L, Booth S A. MicroRNA-146a: A Dominant, Negative Regulator of the Innate Immune Response[J]. Front Immunol, 2014, 5: 578-83.

[14] Park H, Huang X, Lu C, et al. MicroRNA-146a and microRNA-146b regulate human dendritic cell apoptosis and cytokine production by targeting TRAF6 and IRAK1 proteins[J]. J Biol Chem, 2015, 290(5): 2831-2841.

[15] Nakasa T, Miyaki S, Okubo A, et al. Expression of microRNA-146 in rheumatoid arthritis synovial tissue[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(5): 1284-1292.

Gene expression profile of miRNA in joint fluids of patients with rheumatoid arthritis and its clinical significance

LI Li1, LUO Xiaoxing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory; 2.CadreWard,The458thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Guangzhou,Guangdong, 510062)

Objective To detect the gene expression profiles of miRNA in joint fluids of patients with rheumatoid arthritis (RA) and healthy people and clinical significance. Methods The expressions of miRNAs in joint fluids of 3 RA patients and 3 healthy adults were detected by miRNA chip technology, and miRNAs with significant differential expressions were selected to be validated by the qRT-PCR. Correlations between selected miRNA and clinical and laboratory indexes of RA were analyzed. Results In the gene expression profile of miRNA in joint fluids of patients with RA, the expressions of 23 miRNAs significantly changed when compared with those in the healthy people. The results of selected miRNAs by qRT-PCR were correspond with the Results of the miRNA chip technology. The difference of miR-146a expression in joint fluid between RA patients and healthy controls was the most significant. Pearson correlation analysis showed that serum miR-146a expression in joint fluid of RA patients was positively correlated with rheumatoid factor (RF) value and DAS28 score. ROC curve analysis showed that the area under the curve (AUC) of miR-146a was 0.71, and the sensitivity and the specificity of miR-146a in joint fluid in predicting RA were 85.29% and 61.54% respectively. Conclusion There is significant difference in expression of miRNAs in joint fluid between RA patients and healthy people. Expression of miR-146a increases significantly in joint fluid of RA patients, and it level is significantly correlated with the clinical and laboratory indexes of RA.

rheumatoid arthritis; miRNA chip; joint fluid; miR-146a

2017-03-14

R 593.22

A

1672-2353(2017)13-051-05

10.7619/jcmp.201713014