梁 倩 房靜遠(yuǎn) 張 潔 洪 潔#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化科 上海市消化疾病研究所1(200001) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科2

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TRIM55在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義*

梁 倩1房靜遠(yuǎn)1張 潔2#洪 潔1#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化科 上海市消化疾病研究所1(200001) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科2

背景：TRIM55為TRIM蛋白家族成員，大部分TRIM蛋白含環(huán)指結(jié)構(gòu)域，可發(fā)揮E3泛素連接酶的作用，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目的：探討TRIM55在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義，探究可能的作用機(jī)制。方法：選取2014年10月—2015年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的70例結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)癌旁組織，以實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)TRIM55表達(dá)。將TRIM55小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRIM55、SOCS1蛋白表達(dá)。結(jié)果：49例結(jié)直腸癌組織中TRIM55表達(dá)高于癌旁組織，且TRIM55高表達(dá)與腫瘤分化程度(P=0.032)、AJCC分期(P=0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.001)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和脈管侵犯無關(guān)(P>0.05)。TRIM55 siRNA可有效下調(diào)HCT116細(xì)胞中TRIM55 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.01)，降低細(xì)胞增殖能力(P<0.01)，并上調(diào)SOCS1蛋白表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論：E3泛素連接酶TRIM55可能通過影響SOCS1的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的疾病進(jìn)程，提示檢測(cè)TRIM55表達(dá)有望為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新思路。

泛素化； TRIM55； 結(jié)直腸腫瘤； RNA, 小分子干擾； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制因子

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。在美國，雖然結(jié)直腸癌發(fā)病率正逐年降低，但其導(dǎo)致的死亡率仍不可忽視[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，通常是在多種致腫瘤因素的共同作用下逐級(jí)轉(zhuǎn)化發(fā)生[2]。其中炎-癌途徑是結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中的重要途徑之一[3]。有報(bào)道[4]表明，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)作為一種炎癥抑制因子，其缺失和失活與結(jié)直腸癌(尤其是炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌)的發(fā)生密切相關(guān)。TRIM55為TRIM蛋白家族成員，TRIM家族因多含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING-finger domain)而發(fā)揮E3泛素連接酶的作用，可對(duì)多種蛋白進(jìn)行特異性識(shí)別并降解從而影響其表達(dá)水平[5]，包括SOCS1[6]。

本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌患者中TRIM55表達(dá)，并以TRIM小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況以及SOCS1蛋白表達(dá)，旨在探討TRIM55在結(jié)直腸癌中的可能作用機(jī)制，從而為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取2014年10月—2015年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的70例結(jié)直腸癌患者，診斷經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。同時(shí)選取距病變邊緣5 cm以上的癌旁組織作為對(duì)照。其中男37例，女33例；年齡28～82歲，平均66歲；腫瘤大小<30 cm3者50例，≥30 cm3者20例；中-高分化18例，低分化52例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)分期，Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期38例；浸潤局限于黏膜層或肌層者14例，漿膜或全層者56例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移13例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移57例；侵犯脈管8例，無脈管侵犯62例。入選者住院前未接受過手術(shù)、放化療或免疫抑制劑治療。入選者均取得知情同意，本研究方案通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

二、主要儀器和材料

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)；RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-Time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；內(nèi)參GAPDH引物和TRIM55特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116(ATCC)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，序列見表1；DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑(GE Healthcare)；CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；小鼠TRIM55單克隆抗體(英國Abcam公司)、小鼠SOCS1單克隆抗體(美國Millipore公司)、HRP標(biāo)記的內(nèi)參GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(康成生物工程有限公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國ThermoFisher Scientific)。

表1 各基因siRNA序列

三、研究方法

1. 實(shí)時(shí)PCR法：結(jié)腸組織充分研磨后裂解細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)PCR步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。以2-△△Ct法計(jì)算樣本目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，以2.0×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的操作步驟參照DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑說明書，以無血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞后每孔加入無血清培養(yǎng)基1 mL，然后加入5 μL siRNA。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換含5%胎牛血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24～72 h。

3. 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：HCT116細(xì)胞按2 500個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每組處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后行siRNA轉(zhuǎn)染。加入CCK-8試劑(以無血清培養(yǎng)基按照1∶10的體積比稀釋)，分別于培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。使用酶標(biāo)儀讀取450 nm波長處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：將HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 48～72 h后，收集細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌，加入蛋白裂解液裂解10 min，4 ℃ 6 250×g離心10 min，取上清，BCA法定量蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣，行10% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h。分別加入TRIM55、SOCS1、GAPDH一抗(工作濃度分別為1∶1 000、1∶500、1∶3 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5次×5 min，加入二抗(工作濃度1∶3 000)常溫孵育1 h。ECL發(fā)光法成像并進(jìn)行灰度掃描。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌患者中TRIM55表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

在70例結(jié)直腸癌患者中，49例TRIM55表達(dá)高于癌旁組織，平均相對(duì)表達(dá)量為2.26±1.22；21例TRIM55表達(dá)低于癌旁組織，平均相對(duì)表達(dá)量為0.53±0.26。TRIM55高表達(dá)與腫瘤分化程度(P=0.032)、AJCC分期(P=0.001)和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)相關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和脈管侵犯等無關(guān)(P>0.05)(表2)。

二、HCT116細(xì)胞中TRIM55 mRNA和蛋白表達(dá)

實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染兩條TRIM55 siRNA的HCT116細(xì)胞中，TRIM55 mRNA表達(dá)均顯著降低(抑制率分別為78.4%和87.2%，P<0.001)(圖1A)，蛋白表達(dá)亦顯著降低(抑制率分別為46.2%和60.5%，P<0.01)(圖1B)，提示siRNA可有效下調(diào)HCT116細(xì)胞中TRIM55 mRNA和蛋白表達(dá)。

三、HCT116細(xì)胞增殖情況

與對(duì)照組相比，兩組TRIM55 siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖均受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

四、TRIM55表達(dá)降低對(duì)HCT116細(xì)胞中SOCS1表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后，兩組TRIM55 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中SOCS1蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)(圖3)。說明TRIM55對(duì)SOCS1蛋白表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。

表2 結(jié)直腸癌患者中TRIM55表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

臨床病理特征例數(shù)TRIM55表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)P值性別 男3714230.130 女33726年齡(歲) <65289190.794 ≥65421230腫瘤大小 <30cm35018320.083 ≥30cm320317分化程度 中-高分化18990.032 低分化521240AJCC分期 Ⅰ+Ⅱ期3216160.001 Ⅲ+Ⅳ期38533浸潤深度 肌層或黏膜層14590.745 漿膜或全層561640淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無3216160.001 有38533遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 無5719380.317 有13211脈管侵犯 無6219431.000 有826

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后HCT116細(xì)胞增殖情況(CCK-8法)

1 Da=0.992 1 u

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA后HCT116細(xì)胞中SOCS1蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

既往諸多研究發(fā)現(xiàn)，泛素化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一個(gè)常見方式，在蛋白質(zhì)降解和信號(hào)通路調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7]。泛素化作用由一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成，其中包括三種重要的酶，分別為E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶。E1泛素激活酶可利用ATP供能黏附于泛素分子的半胱氨酸殘基上，隨后將泛素分子轉(zhuǎn)移至E2泛素結(jié)合酶。E3泛素連接酶的作用最為關(guān)鍵，一方面可特異性識(shí)別靶蛋白，另一方面定位于E2泛素結(jié)合酶以轉(zhuǎn)移泛素分子，從而形成泛素與底物蛋白的復(fù)合物被蛋白酶體水解[8]。TRIM蛋白家族因多含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域而發(fā)揮E3泛素連接酶的作用，可識(shí)別并降解多種蛋白，從而引起其表達(dá)水平以及相關(guān)信號(hào)通路的改變[5]。由于降解的靶蛋白不同，TRIM蛋白既有促癌亦有抑癌的作用。如Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smurf2)是一種E3泛素連接酶，有研究發(fā)現(xiàn)Smurf2可依賴其泛素連接酶的活性參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等過程，從而與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]；TRIM59可使野生型p53泛素化并降解，但對(duì)突變型p53無此作用，阻礙了p53作為抑癌基因的功能，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展[10]；在非小細(xì)胞肺癌中，TRIM71可通過對(duì)RNA結(jié)合蛋白Lin28B的泛素化作用，使其表達(dá)減少，抑制下游let-7-HMGA2信號(hào)的激活，從而發(fā)揮其抑癌基因的作用[11]；TRIM3是一種定位于11號(hào)染色體的抑癌基因，通過降解p21削弱細(xì)胞周期蛋白D1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)的聚積，進(jìn)而抑制腫瘤生長，其表達(dá)降低可引起血小板源性生長因子誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤發(fā)病率的增加[12]。

TRIM蛋白調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用途徑各不相同，包括調(diào)節(jié)自噬[13]、組蛋白[14]和免疫應(yīng)答反應(yīng)[15]等。Versteeg等[15]在人類已知的75種TRIM蛋白中進(jìn)行cDNA克隆和系統(tǒng)分析，證實(shí)約一半的TRIM蛋白可從固有免疫信號(hào)通路的多個(gè)水平進(jìn)行調(diào)控，從而影響固有免疫反應(yīng)。SOCS1可負(fù)性調(diào)控細(xì)胞因子引起的信號(hào)通路激活，發(fā)揮潛在的炎癥抑制因子的作用，并減緩腫瘤細(xì)胞的生長，因此在多種腫瘤包括結(jié)直腸癌中起抑癌的作用[4]。TRIM蛋白與SOCS1之間的相互作用降低了SOCS1的穩(wěn)定性和表達(dá)水平，可阻斷SOCS1的抑癌功能[6]。

本研究檢測(cè)了70例結(jié)直腸癌患者中TRIM55 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，49例TRIM55表達(dá)高于癌旁組織，且TRIM55高表達(dá)與腫瘤分化程度、AJCC分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。提示TRIM55表達(dá)可能與結(jié)直腸癌患者的惡性程度以及病變累及范圍有關(guān)。本研究進(jìn)一步將TRIM55 siRNA轉(zhuǎn)染人低分化結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116，結(jié)果顯示TRIM55 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，HCT116細(xì)胞增殖受到明顯抑制，而SOCS1蛋白表達(dá)明顯升高。這一結(jié)果可能是由于siRNA削弱了TRIM55對(duì)SOCS1的泛素化降解作用。而在結(jié)直腸癌中，TRIM55高表達(dá)使SOCS1的降解異常增加，SOCS1水平降低，使其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用受到破壞，導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生了變化，進(jìn)而加速疾病進(jìn)程。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者的TRIM55表達(dá)水平升高，且與腫瘤分化程度、AJCC分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能在促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，其發(fā)揮作用的潛在機(jī)制可能是降解SOCS1。但TRIM55是否通過泛素化修飾的方式在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用迄今仍未見相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)可通過完善這一部分內(nèi)容，使TRIM55有望成為診斷和治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)。

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(2016-12-14收稿；2017-02-20修回)

Expression and Clinical Significance of TRIM55 in Colorectal Cancer

LIANGQian1,FANGJingyuan1,ZHANGJie2,HONGJie1.

1DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenJiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,Shanghai(200001);2DepartmentofClinicalLaboratory,RenJiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai

Co-correspondence to: ZHANG Jie, Email: jane_zhanlin@sina.cn; HONG Jie, Email: jiehong97@shsmu.edu.cn

Background: TRIM55 is a member of TRIM family. Most TRIM proteins, which can be defined as E3 ubiquitin ligase because of the RING-finger domain, are closely related with the initiation and progression of cancer. Aims: To study the expression and clinical significance of TRIM55 in colorectal cancer, and explore the potential mechanism of TRIM55 in colorectal cancer. Methods: Seventy colorectal cancer tissues and corresponding paracancerous tissues taken from colorectal cancer patients from October 2014 to December 2015 at Shanghai Ren Ji Hospital were enrolled. Real-time PCR was performed to examine the expression of TRIM55. Human colorectal cancer cell line HCT116 was transfected with TRIM55 small interfering RNA (siRNA), cell proliferation was measured by CCK-8 assay, Western blotting was implemented to determine the protein expressions of TRIM55 and SOCS1. Results: The expression of TRIM55 was significantly increased in 49 colorectal cancer tissues than in corresponding paracancerous tissues. Increased expression of TRIM55 was closely correlated with tumor differentiation (P=0.032), AJCC staging (P=0.001) and lymph node metastasis (P=0.001), but not related to gender, age, tumor size, invasion depth, distant metastasis and vascular invasion (P>0.05). After transfection with TRIM55 siRNA, mRNA and protein expressions of TRIM55 were significantly decreased (P<0.01), proliferation of HCT116 cells was significantly decreased (P<0.01), and protein expression of SOCS1 was significantly increased (P<0.01). Conclusions: E3 ubiquitin ligase TRIM55 may promote the proliferation of colorectal cancer cells via influencing the expression of SOCS1, thus promoting the progression of colorectal cancer. This indicates that detection of TRIM55 expression may provide a new approach for diagnosis and therapy of colorectal cancer.

Ubiquitination; TRIM55; Colorectal Neoplasms; RNA, Small Interfering; Cell Proliferation; Suppressor of Cytokine Signaling Proteins

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.06.005

*本課題由臨床專職科研隊(duì)伍(20152512)資助

#本文共同通信作者，張潔，Email: jane_zhanlin@sina.cn；洪潔，Email: jiehong97@shsmu.edu.cn