杜頤林，張旭輝，李 勇

(西南大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715)

生防外生菌根真菌的篩選及其生長和發(fā)酵條件優(yōu)化

杜頤林，張旭輝，李 勇*

(西南大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715)

為了篩選具有廣譜拮抗活性的外生菌根真菌，采用平板對(duì)峙法(初篩)和生長速率法(復(fù)篩)測定了6種外生菌根真菌對(duì)5種常見植物病原真菌的抑制活性，通過單因素試驗(yàn)對(duì)抑制效果較好的生防菌進(jìn)行生長及發(fā)酵條件優(yōu)化。結(jié)果表明，彩色豆馬勃Pt01在初篩試驗(yàn)中對(duì)植物病原真菌的抑菌率為40.1%～49.7%，在復(fù)篩試驗(yàn)中抑菌率為78.5%～91.8%，抑菌作用整體高于其他外生菌根真菌。條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，Pt01在28 ℃、pH值為7.0、碳源為乳糖、氮源為硝酸鉀時(shí)生長最好；其最佳發(fā)酵條件：溫度為30 ℃，初始pH值為6.0，碳源為乳糖，氮源為酵母膏，時(shí)間為5 d，轉(zhuǎn)速對(duì)不同病原真菌抑菌率各有不同影響，需要單獨(dú)考慮最佳轉(zhuǎn)速。彩色豆馬勃菌株P(guān)t01對(duì)5種受試病原真菌均有明顯的抑制作用，優(yōu)化其生長和發(fā)酵條件為其在植物病害防治上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

外生菌根真菌； 篩選； 植物病原真菌； 抑制作用； 條件優(yōu)化

外生菌根真菌是一種十分豐富的資源，不僅能增大宿主根系的吸收面積[1-3]，改善植物營養(yǎng)[4-6]，調(diào)節(jié)植物代謝，提高植物產(chǎn)品品質(zhì)[7-9]，而且可以通過重寄生作用，或產(chǎn)生多種酶類物質(zhì)、抗生素和揮發(fā)性物質(zhì)，抑制病原菌，增強(qiáng)植物抗病能力[10-11]。此外，利用外生菌根真菌研發(fā)生物農(nóng)藥，不僅毒性小、殘留低，而且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[12]，外生菌根真菌在生物防治、生態(tài)穩(wěn)定和環(huán)境安全等方面所表現(xiàn)出的巨大研究潛力和應(yīng)用價(jià)值愈發(fā)引起人們的關(guān)注。

外生菌根真菌在防治植物病害、提高植物抗病能力方面的研究日益豐富。欒慶書等[10]研究表明，彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)能夠抑制立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)生長。吳小芹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，彩色豆馬勃對(duì)松枯梢病菌(Sphaeropsissapinea)有明顯抑制作用。趙志鵬等[14]發(fā)現(xiàn)，灰褐牛肝菌(Boletusgriseus)對(duì)立枯絲核菌有明顯的拮抗作用。但是，目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的生防菌株基本上均是對(duì)單一病原真菌具有防治效果，具有廣譜抑菌活性的生防外生菌根真菌研究較少，尤其是對(duì)核盤菌、擬盤多毛孢菌、柑橘炭疽病菌等均有抑制作用的生防真菌尚未見報(bào)道。為此，從保存的生防外生菌根真菌中篩選對(duì)柑橘炭疽病菌等5種病原真菌均有顯著拮抗效果的生防菌株，并對(duì)其生長和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為補(bǔ)充廣譜抑菌的生防菌資源及其實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 外生菌根真菌：采自四川西昌的彩色豆馬勃Pt715、采自云南普洱的彩色豆馬勃Pt01、采自云南普洱的松乳菇(Lactariusdeliciosus)Srg01、采自重慶縉云山的松乳菇LD2、采自重慶金佛山的褐環(huán)乳牛肝菌(Suillusluteus)N7、采自內(nèi)蒙古大青山的網(wǎng)紋灰包(Lycoperdonperlatum)LP。以上菌株均保存于西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

植物病原真菌：柑橘炭疽病菌(Colletotrichumgloeosprioides)、油菜核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)，松立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)、擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisversicolor)。以上菌株均由西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 外生菌根真菌生長培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖20 g、酒石酸銨0.5 g、維生素B10.1 g、瓊脂15～20 g、微量元素混合液[8.45 mg/L H3BO3、5 mg/L MnSO4、6 mg/L FeSO4、0.625 mg/L CuSO4、2.77 mg/L ZnCl2、0.27 mg/L (NH4)2MoO4，pH值5.5] 1.0 mL，蒸餾水定容至1 000 mL。

外生菌根真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖20 g、酒石酸銨0.5 g、維生素B10.1 g、微量元素混合液1.0 mL，蒸餾水定容至1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

PDA改良培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酒石酸銨0.5 g、維生素B10.1 g、微量元素混合液1.0 mL，蒸餾水定容至1 000 mL。1.2 生防外生菌根真菌的篩選

為了逐步規(guī)范院區(qū)的各項(xiàng)收費(fèi)和結(jié)算工作，財(cái)務(wù)部門會(huì)同相關(guān)部門和單位共同完成了院區(qū) “一卡通”結(jié)算中心的搭建工作，并委托物業(yè)公司負(fù)責(zé)系統(tǒng)前臺(tái)的運(yùn)行和管理，軟件負(fù)責(zé)后臺(tái)數(shù)據(jù)的運(yùn)維和上傳。為全院職工辦理園區(qū)卡，實(shí)現(xiàn)餐卡的充值和消費(fèi)。并設(shè)計(jì)將院區(qū)的各項(xiàng)收費(fèi)業(yè)務(wù)逐步納入結(jié)算系統(tǒng)進(jìn)行管理，統(tǒng)一納入財(cái)務(wù)信息系統(tǒng)集中管理，加強(qiáng)對(duì)收費(fèi)和結(jié)算工作的核實(shí)和監(jiān)督，不斷提高服務(wù)全院的水平。

1.2.1 初篩 采用平板對(duì)峙法[15]，將活化的外生菌根真菌和病原真菌打成直徑5 mm的菌餅，分別接種在相距3 cm處的PDA改良培養(yǎng)基上，構(gòu)成兩點(diǎn)對(duì)峙，以只接病原真菌菌餅的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察，通過十字交叉法測量病原真菌的菌落直徑，并計(jì)算抑菌率[16]。每個(gè)處理重復(fù)3次，根據(jù)抑菌率的大小，篩選出拮抗效果良好的菌株。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.2 復(fù)篩 選取初篩試驗(yàn)中對(duì)病原真菌拮抗能力較強(qiáng)的外生菌根真菌，采用生長速率法[17]測定其無菌發(fā)酵液的抑菌活性。將5塊直徑5 mm的生防菌菌餅接種到外生菌根真菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d后，8 500 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm的無菌濾膜過濾，得到無菌濾液。然后按體積1∶5的比例加入冷卻至50 ℃的外生菌根真菌生長培養(yǎng)基中，制備成混合培養(yǎng)基，冷卻徹底后，將直徑為5 mm的病原真菌菌餅接到平板中央，以未接種外生菌根真菌的無菌發(fā)酵液為對(duì)照組，于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，按照1.2.1的方法計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理重復(fù)3次，根據(jù)抑菌率的大小，篩選出抑菌活性較強(qiáng)的生防菌株。

1.3 生防菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

研究不同溫度、pH值、碳源、氮源對(duì)生防菌株生長的影響：在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，將篩選得到的拮抗效果良好的菌株分別置于20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃和35 ℃下培養(yǎng)；分別調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.0、6.0、7.0和8.0；以20 g/L的添加量，分別用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和乳糖為菌株生長提供碳源；以0.5 g/L的添加量，分別用硝酸鉀、硝酸銨、酵母膏和蛋白胨替代生長培養(yǎng)基中的酒石酸銨，為菌株生長提供氮源。每個(gè)處理重復(fù)3次，采用十字交叉法于培養(yǎng)3 d后測量菌落直徑，以菌落大小表征生長優(yōu)劣。

1.4 生防菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)對(duì)生防菌株的發(fā)酵條件包括發(fā)酵溫度、初始pH值、碳源、氮源、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化研究。設(shè)置不同發(fā)酵溫度(25、28、30、35 ℃)、不同初始pH值(5.0、6.0、7.0、8.0)、不同碳源(蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖)、不同氮源(硝酸鉀、硝酸銨、酵母膏、蛋白胨)、不同轉(zhuǎn)速(100、140、180、220 r/min)、不同發(fā)酵時(shí)間(3、5、7、9 d)進(jìn)行發(fā)酵，以考察發(fā)酵條件對(duì)生防菌株抑菌活性的影響。按照1.2.2的方法得到生防菌株無菌濾液，然后移取3 mL無菌濾液至24 mL的外生菌根真菌生長培養(yǎng)基中，制備成混合培養(yǎng)基，冷卻后將直徑為5 mm的病原真菌菌餅接到平板中央，以未接種外生菌根真菌的無菌發(fā)酵液為對(duì)照組，每組處理均設(shè)3次重復(fù)，參照1.2.1的方法計(jì)算得到不同發(fā)酵條件下的抑菌率。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行均值差異顯著性檢驗(yàn)，Duncan’s法進(jìn)行多重比較；應(yīng)用Excel 2007進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 初篩 由表1可知，通過平板對(duì)峙初篩，得到3株拮抗效果較好的生防菌株N7、Pt01和Srg01。其中，菌株N7對(duì)柑橘炭疽病菌和西瓜蔓枯病菌的抑菌率最高，分別為42.6%、52.9%；菌株P(guān)t01對(duì)油菜核盤菌、松立枯絲核菌和擬盤多毛孢菌的抑菌率最高，分別為44.4%、45.3%、49.7%；菌株Srg01對(duì)5種植物病原真菌也均有較高的抑菌率，為30.0%～49.7%。因此，可以初步確定Srg01、Pt01和N7為目標(biāo)生防菌株。

表1 外生菌根真菌對(duì)病原真菌的抑菌率 %

注：在同一列中不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2 復(fù)篩 表2結(jié)果顯示，在復(fù)篩試驗(yàn)中菌株P(guān)t01對(duì)5種病原真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，其中，對(duì)油菜核盤菌的抑菌率最高，達(dá)到91.8%，對(duì)其他病原真菌的抑菌率為78.5%～88.1%，均高于另2株生防真菌。綜合分析，確定菌株P(guān)t01為最有效的生防外生菌根真菌。

表2 優(yōu)良菌株無菌發(fā)酵濾液對(duì)病原真菌的抑菌率 %

2.2 生防菌株P(guān)t01培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)生防菌株生長的影響 如圖1所示，外生菌根真菌Pt01的菌落直徑隨著溫度的升高，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在28 ℃條件下達(dá)到最大，說明其最適生長溫度為28 ℃，屬于典型的中溫菌。Pt01在35 ℃下幾乎不能正常生長，可能是溫度過高對(duì)菌株體內(nèi)的代謝酶產(chǎn)生負(fù)面影響，抑制了其生長。

不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2.2 pH值對(duì)生防菌株生長的影響 由圖2可知，在pH值5.0～8.0范圍內(nèi)，菌株P(guān)t01均能生長，但其在pH值為5.0和6.0時(shí)菌落較小，分別為1.8 cm和1.9 cm，并且與另外2個(gè)處理間均差異顯著(P<0.05)；pH值為7.0時(shí)，菌株P(guān)t01的菌落直徑最大，達(dá)到3.2 cm，與pH值8.0處理達(dá)到顯著差異水平。因此，菌株P(guān)t01最適生長pH值為7.0。

圖2 pH值對(duì)生防菌株P(guān)t01生長的影響

2.2.3 碳源對(duì)生防菌株生長的影響 圖3顯示，菌株P(guān)t01能利用所有供試碳源，但其最適碳源為乳糖，此時(shí)菌落直徑為3.3 cm，分別是蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的1.27倍、1.50倍和1.32倍。

圖3 碳源對(duì)生防菌株P(guān)t01生長的影響

2.2.4 氮源對(duì)生防菌株生長的影響 圖4結(jié)果表明，菌株P(guān)t01能利用所有供試氮源，但其最適氮源為硝酸鉀，此時(shí)菌落直徑為3.5 cm，分別是硝酸銨、酵母膏和蛋白胨的1.21倍、1.10倍和1.17倍。

圖4 氮源對(duì)生防菌株P(guān)t01生長的影響

2.3 生防菌株P(guān)t01發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)生防菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響 如圖5所示，隨著溫度的升高，菌株P(guān)t01發(fā)酵液對(duì)供試病原真菌的抑菌率先升高后降低，在30 ℃時(shí)抑菌率均達(dá)到最大，在此溫度下，菌株P(guān)t01發(fā)酵濾液對(duì)油菜核盤菌、松立枯絲核菌、西瓜蔓枯病菌的抑菌率分別為42%、49%、57%，對(duì)柑橘炭疽病菌和擬盤多毛孢菌的抑菌率分別為37%、17%。30 ℃處理的抑菌率與其他溫度處理間均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，表明菌株P(guān)t01的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)菌株P(guān)t01無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3.2 初始pH值對(duì)生防菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響 在一定范圍內(nèi)，菌株P(guān)t01發(fā)酵液對(duì)供試病原真菌的抑菌率隨著pH值的升高表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(圖6)，當(dāng)pH值為6.0時(shí)抑菌率均達(dá)到最高，其對(duì)松立枯絲核菌、西瓜蔓枯病菌、柑橘炭疽病菌和擬盤多毛孢菌的抑菌率分別達(dá)到了69%、51%、50%、45%，與其他pH值處理間均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，表明菌株P(guān)t01發(fā)酵的最適初始pH值為6.0。

圖6 初始pH值對(duì)菌株P(guān)t01無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3.3 不同碳源對(duì)生防菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響 圖7結(jié)果顯示，在4種供試碳源中，以乳糖作為碳源時(shí)菌株P(guān)t01發(fā)酵液的抑菌效果最好，此時(shí)，其對(duì)西瓜蔓枯病菌、擬盤多毛孢菌和柑橘炭疽病菌的抑菌率分別是68%、43%、40%。因此，選用乳糖作為菌株P(guān)t01的發(fā)酵碳源。

圖7 不同碳源對(duì)菌株P(guān)t01無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3.4 不同氮源對(duì)生防菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響 如圖8所示，以酵母膏作為氮源時(shí)，菌株P(guān)t01發(fā)酵液對(duì)5種病原真菌的抑菌活性均達(dá)到最大值，其中對(duì)西瓜蔓枯病菌的抑菌率可以達(dá)到69%，顯著高于其他處理的抑菌率(P<0.05)。因此，選擇酵母膏作為生防菌株P(guān)t01的最佳發(fā)酵氮源。

圖8 不同氮源對(duì)菌株P(guān)t01無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3.5 轉(zhuǎn)速對(duì)生防菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響 由圖9可知，菌株P(guān)t01發(fā)酵液對(duì)不同病原真菌產(chǎn)生最高抑菌率時(shí)轉(zhuǎn)速各不相同。轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，Pt01對(duì)油菜核盤菌和擬盤多毛孢菌的抑菌率最高；轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，對(duì)松立枯絲核菌和柑橘炭疽病菌的抑菌率最高；而當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，其對(duì)西瓜蔓枯病菌的抑菌率最高，達(dá)到73%。但不同真菌最高抑菌率所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)速處理與其他處理間均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。不同轉(zhuǎn)速對(duì)不同病原真菌具有不同的影響，因此，需要分別考慮轉(zhuǎn)速以達(dá)到理想的效果。

圖9 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株P(guān)t01無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)生防菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響 在一定范圍內(nèi)，菌株P(guān)t01發(fā)酵液的抑菌率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(圖10)，其對(duì)擬盤多毛孢菌的抑菌率在發(fā)酶7 d時(shí)最大，達(dá)到43.2%，與其他時(shí)間處理間達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，而對(duì)另外4種病原真菌的抑菌率均在發(fā)酶5 d時(shí)達(dá)到最大，隨后開始逐漸降低，其原因可能是超過5 d后，菌株的生長進(jìn)入衰退階段，使得抑菌活性大大降低。綜合考慮，確定最適發(fā)酵時(shí)間為5 d，但若僅針對(duì)擬盤多毛孢菌，菌株P(guān)t01的最適發(fā)酵時(shí)間為7 d。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株P(guān)t01無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

3 結(jié)論與討論

利用外生菌根真菌防治植物病害已有較多研究，但關(guān)于其生長和發(fā)酵條件的研究相對(duì)較少，這是因?yàn)橥馍婢芡饨绫姸嗟沫h(huán)境因子(如pH值、溫度、重金屬、鹽濃度以及營養(yǎng)元素的供給等)影響較大[18]，不能具體確定其最適條件，只能比較某一時(shí)期或相對(duì)條件下的生防效果。外生菌根真菌的生長和代謝是保證其發(fā)揮高效生防作用的基礎(chǔ)，其抑菌活性的高低與培養(yǎng)條件密切相關(guān)。欒竹青等[19]采用單因素試驗(yàn)對(duì)乳牛肝菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，其生長狀況顯著改善。張揚(yáng)等[20]對(duì)紅絨蓋牛肝菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液對(duì)楊樹潰瘍病的防治效果有所提高。

本研究通過平板對(duì)峙法和生長速率法篩選得到一株對(duì)5種常見病原真菌拮抗效果明顯的外生菌根真菌Pt01，其發(fā)酵液對(duì)油菜核盤菌的抑菌率高達(dá)91.8%，對(duì)柑橘炭疽病菌、松立枯絲核菌、擬盤多毛孢菌的抑菌率也均在80%以上。為了實(shí)現(xiàn)生防菌株P(guān)t01的應(yīng)用，對(duì)其生長和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最適生長條件：溫度為28 ℃，pH值為7.0，碳源為乳糖，氮源為硝酸鉀；最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為30 ℃，初始pH值為6.0，碳源為乳糖，氮源為酵母膏，發(fā)酵時(shí)間為5 d，轉(zhuǎn)速對(duì)不同病原真菌具有不同的影響，需要分別考慮最適轉(zhuǎn)速。

生防菌從試驗(yàn)階段到田間應(yīng)用是一個(gè)復(fù)雜的過程，試驗(yàn)條件下獲得的拮抗效果較為理想的生防菌株，能否在田間發(fā)揮高效生防作用，并保持穩(wěn)定增殖，甚至形成優(yōu)勢種群，這是生防菌大規(guī)模商品化應(yīng)用需要考慮的關(guān)鍵因子[21-23]。因此，對(duì)于本研究篩選到的生防外生菌根真菌，需要進(jìn)一步研究定殖特性、田間防效及生物安全性等。

[1] 李月蛟,朱利英,尹華軍,等.連續(xù)三年夜間增溫和施氮對(duì)云杉外生菌根及菌根真菌多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(9):2967-2977.

[2] 王琴.外生菌根及其在現(xiàn)代林業(yè)中的應(yīng)用[J].遼寧林業(yè)科技,2014(1):32-35.

[3] 宋微,吳小芹,葉建仁.6種外生菌根真菌對(duì)895楊礦質(zhì)營養(yǎng)吸收的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,35(2):35-38.

[4] 劉潤進(jìn),陳應(yīng)龍.菌根學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2007.

[5] 王藝,丁貴杰.外生菌根對(duì)馬尾松幼苗生長、生理特征和養(yǎng)分的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,37(2):97-102.

[6] 崔磊,穆立薔.黑龍江省紫椴典型分布區(qū)外生菌根形態(tài)與解剖特征[J].生態(tài)學(xué)雜志,2014,33(9):2490-2500.

[7] Zhang Y,Xu Y Z,Zheng Z X,etal.Analyses of diversity and distribution characteristics of macrofungi in Huafo Mountain Nature Reserve of Yunnan province[J].Journal of Plant Resources and Environment,2012,21(1):111-117.

[8] 樊永軍,閆偉,王黎元.賀蘭山地區(qū)青海云杉外生菌根的形態(tài)[J].林業(yè)科學(xué),2011,47(6):108-113.

[9] Liang Y,Guo L D,Ma K P.Spatial pattern of the most common late stage ectomycorrhizal fungi in a subtropical forest in Dujiangyan,Southwest of China [J].Acta Botanica Sinica,2004,46(1):29-34.

[10] 欒慶書,吳元華,白慧敏.外生菌根真菌對(duì)病原菌拮抗作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].遼寧林業(yè)科技,2009(5):52-54.

[11] Sen R.Multitrophic interactions between aRhizoctoniasp.and mycorrhizal fungi affect Scots pine seedling performance in nursery soil [J].New Phytologist,2001,152(3):543-553.

[12] 宋秀杰,郝國防.生物農(nóng)藥及生物防治[J].環(huán)境保護(hù),2002(6):28-30.

[13] 吳小芹,孫民琴,高悅,等.幾種外生菌根菌對(duì)松苗抗非根部病害的影響[J].林業(yè)科學(xué),2007,43(6):88-93.

[14] 趙志鵬,郭秀珍.外生菌根真菌純培養(yǎng)中生理活性物質(zhì)代謝的研究[J].林業(yè)科學(xué),1990,26(5):465-469.

[15] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1998:376-377.

[16] 曹明慧,冉煒,楊興明,等.煙草黑脛病拮抗菌的篩選及其生物效應(yīng)[J].土壤學(xué)報(bào),2011,48(1):151-159.

[17] 廖庭,秦健,袁高慶,等.巨大芽孢桿菌B196菌株抑菌物質(zhì)的分離純化[J].植物保護(hù),2014,40(2):16-21.

[18] 溫祝桂,陳亞華.中國外生菌根真菌研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2013(2):22-30.

[19] 欒竹青,由翠榮,梁麗琨,等.乳牛肝菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,46(4):430-437.

[20] 張揚(yáng),葉建仁,趙陽,等.紅絨蓋牛肝菌發(fā)酵條件及對(duì)楊樹潰瘍病的防治效果[J].森林與環(huán)境學(xué)報(bào),2016,36(4):397-403.

[21] 張華,趙輝,王鵬濤,等.解淀粉芽孢桿菌B10-26抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性研究與初步分離純化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(5):93-96.

[22] Benizri E,Baudoin E,Guckert A.Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria[J].Biocontrol Science and Technology,2001,11(5):557-574.

[23] Bloemberg G V,Lugtenberg B J.Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria[J].Current Opinion in Plant Biology,2001,4(4):343-350.

Screening of Antagonistic Ectomycorrhizal Fungi and Optimization of Growth and Fermentation Conditions

DU Yilin,ZHANG Xuhui,LI Yong*

(College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715,China)

In order to screen ectomycorrhizal fungi with a broad spectrum of antagonistic activity,the dual culture assay and growth rate method were performed for determining the inhibitory efficacy of six ectomycorrhizal fungi against five kinds of common plant pathogenic fungi.Subsequently,the growth and fermentation conditions of the strain with a higher inhibitory rate to pathogenic fungi were optimized through the single factor experiment.The results showed thatPisolithustinctoriusPt01 had a better inhibitory efficacy against all the plant pathogenic fungi.In confrontation culture,the inhibitory rates of Pt01 against five kinds of plant pathogenic fungi were from 40.1% to 49.7%,while the inhibitory rates were from 78.5% to 91.8% with growth rate method.After optimized,the growth conditions of Pt01 were temperature of 28 ℃,initial pH of 7.0,lactose as carbon source,and potassium nitrate as nitrogen source.Additionally,the optimum fermentation conditions of Pt01 were temperature of 30 ℃,initial pH of 6.0,lactose as carbon source,yeast extract as nitrogen source,fermentation time of 5 d.The highest inhibitory rates of Pt01 to different pathogenic fungi were obtained at different rotational speed,so rotational speed was necessary to be considered separately for achieving the best inhibitory effect.These results demonstrated that Pt01 had obvious inhibition against five kinds of pathogenic fungi,and the optimization of its growth and fermentation conditions could provide theoretical basis for its application in the prevention and control of plant diseases.

ectomycorrhizal fungi; screening; plant pathogenic fungi; inhibitory efficacy; condition optimization

2016-11-23

西南大學(xué)本科生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(20152402007)

杜頤林(1997-)，男，山西忻州人，在讀本科生，研究方向：環(huán)境微生物。E-mail:441846373@qq.com

*通訊作者：李 勇(1973-)，男，四川西昌人，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail:Liyongwf@swu.edu.cn

S476.1

A

1004-3268(2017)06-0074-06