朱科，宋潔，劉亞巍，孫鳳軍，徐巧玲

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院,a 預(yù)防保健科，b 藥劑科,重慶 400038；2.中央軍委聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處；3.中國人民解放軍第三○五醫(yī)院藥學(xué)部)

·論著·

亞抑菌濃度頭孢洛林對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

朱科1a，宋潔1a，劉亞巍2，孫鳳軍1b，徐巧玲3

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院,a 預(yù)防保健科，b 藥劑科,重慶 400038；2.中央軍委聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處；3.中國人民解放軍第三○五醫(yī)院藥學(xué)部)

目的 探討亞抑菌濃度頭孢洛林對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的影響，為抗菌藥物的臨床使用提供理論依據(jù)。方法 金黃色葡萄球菌抑菌濃度(MIC)檢測采用微量肉湯稀釋法，亞-MIC頭孢洛林對細(xì)菌生物膜形成能力的影響采用96孔板結(jié)晶紫染色法，胞外多糖的檢測采用苯酚-硫酸法，icaA基因的表達(dá)采用熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果 10株MRSA菌株對大部分抗菌藥物具有較高耐藥性，而對呋喃妥因、萬古霉素和頭孢洛林完全敏感。亞-MIC頭孢洛林對7株MRSA菌株的生物膜形成具有顯著誘導(dǎo)作用。此外，亞-MIC頭孢洛林能增加MRSA菌株胞外多糖的產(chǎn)生和icaA基因的表達(dá)。結(jié)論 亞-MIC頭孢洛林可能通過誘導(dǎo)icaA基因表達(dá)而增加胞外多糖的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)菌生物膜形成能力增強(qiáng)。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；生物膜；微生物敏感性試驗(yàn)；頭孢洛林

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是全球醫(yī)院感染的重要革蘭陽性菌，可引起皮膚和手術(shù)部位感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎和肺炎等，具有較高的致死率[1]。近年來，隨著導(dǎo)管和外科植入物等生物材料的應(yīng)用，金黃色葡萄球菌生物膜引起的感染使臨床治療趨于復(fù)雜化[2]。頭孢洛林是頭孢洛林酯前藥的活性代謝物，它是一種新型的頭孢菌素，用于治療成人社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎和急性細(xì)菌性皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染，對包括MRSA在內(nèi)的金黃色葡萄球菌具有較高的體外抗菌活性[3-4]。有研究表明，亞抑菌濃度抗菌藥物能顯著誘導(dǎo)包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的不同種類細(xì)菌的生物膜形成[5-7]。此外，亞抑菌濃度抗菌藥物還能引起細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄的變化[8]。由于頭孢洛林在體內(nèi)治療過程中大部分時間處于亞抑菌濃度水平，因此本研究以MRSA臨床株為研究對象，研究亞抑菌濃度頭孢洛林對MRSA生物膜形成能力的影響，為臨床抗菌藥物的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 10株MRSA臨床株(S1501-S1510)分離自2015年7月至12月第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院臨床送檢標(biāo)本，剔除同一患者的重復(fù)菌株。金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥學(xué)部保存。

1.2 試劑與儀器 頭孢洛林(日本武田制藥，批號：229016-73-3，純度：99%)，哥倫比亞血瓊脂平板(重慶龐通公司)，MH培養(yǎng)基(北京陸橋生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)，RNA提取試劑盒和瓊脂糖(北京天根生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix(東洋紡生物科技有限公司)，引物由Invitrogen公司合成。酶標(biāo)儀(美國MD公司)，Real-Time PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最小抑菌濃度(MIC)的檢測 采用微量肉湯稀釋法檢測MRSA菌株MIC。MRSA菌株劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于10 mL TSB肉湯中，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。細(xì)菌過夜培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉注射溶液稀釋校正至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，然后再用TSB肉湯稀釋100倍備用。頭孢洛林用TSB肉湯倍比稀釋至11個濃度梯度(0.25～256 μg/mL)。然后在96孔板中每孔加入100 μL稀釋菌液和100 μL系列濃度頭孢洛林，生長對照孔中加入100 μL稀釋菌液和100 μL TSB肉湯。37 ℃孵育24 h后觀察結(jié)果。MIC結(jié)果參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)2014年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.3.2 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株生物膜形成能力的影響 采用96孔板結(jié)晶紫染色法檢測MRSA菌株生物膜形成能力[9]。將MRSA過夜培養(yǎng)物用TSB肉湯稀釋1000倍?？瞻讓φ战M每孔加入100 μL菌液和100 μL TSB肉湯；頭孢洛林組每孔加入100 μL菌液和100 μL頭孢洛林，使藥物終濃度為1/4 MIC。96孔板放入37℃孵箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完畢，輕輕吸除浮游菌，用PBS緩沖液輕柔沖洗2次，通風(fēng)處倒置自然風(fēng)干。然后在每孔中加入1%結(jié)晶紫溶液200 μL，染色10 min，自來水沖洗3次，再次通風(fēng)陰涼處倒置自然晾干。最后每孔加入30%冰醋酸溶液100 μL，用酶標(biāo)儀在590 nm處測定其吸光度值。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株胞外多糖的影響 采用苯酚-硫酸法檢測MRSA菌株胞外多糖的產(chǎn)生[10]。按1%接種量將MRSA過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于100 mL TSB和含1/4 MIC頭孢洛林的TSB肉湯中，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)完畢將所有菌液在4 ℃、4000 r/min下離心15 min，去除上清。用蒸餾水重懸離心管底部的沉淀，然后加入37%甲醛溶液300 μL，4 ℃條件下放置3 h。然后加入20 mL 1M NaOH，4 ℃再放置3 h。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，去除上清，留取沉淀待查。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液為底物制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述待測沉淀稀釋后按同樣的方法進(jìn)行顯色，然后在490 nm處測定其吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的多糖含量。

1.3.4 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株ica基因表達(dá)的影響 采用熒光定量PCR檢測亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株icaA基因表達(dá)的影響。采用Primer Premier 6.0軟件針對icaA基因序列設(shè)計(jì)引物。icaA-F：CTTGGATGCAGATACTATCG；icaA-R：GCGTTGCTTCCAAAGACCTC。MRSA菌株劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。分別挑取單菌落于10 mL TSB和含1/4 MIC頭孢洛林的TSB肉湯中，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。按照RNA抽提試劑盒說明書提取細(xì)菌總RNA，并用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃ 10 min，30 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。反應(yīng)完畢cDNA放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩T-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR Green 10 μL，上下游引物各0.3 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)完成后以16S rRNA作為內(nèi)參進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MRSA菌株MIC結(jié)果 常用抗菌藥物對MRSA菌株的MIC結(jié)果見表1。10株MRSA菌株對苯唑西林和紅霉素完全耐藥，對克林霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素具有較高耐藥性。而所有菌株均對呋喃妥因、萬古霉素和頭孢洛林敏感。

2.2 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株生物膜形成能力的影響 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株生物膜形成能力的影響如圖1所示。1/4 MIC頭孢洛林對MRSA菌株生物膜形成具有不同程度的誘導(dǎo)作用，其中對7株菌的生物膜形成具有顯著誘導(dǎo)作用(P<0.05)。

表1 常用抗菌藥物對MRSA菌株的MIC結(jié)果(mg/L)

與空白對照組比較，aP<0.05

2.3 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株胞外多糖產(chǎn)生的影響 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株胞外多糖產(chǎn)生的影響見表2。除S1510菌株外，1/4 MIC頭孢洛林可以顯著誘導(dǎo)其他MRSA菌株胞外多糖的產(chǎn)生(P<0.05)。

2.4 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株ica基因表達(dá)的影響 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株icaA基因表達(dá)的影響如圖2所示。與空白對照組相比，1/4 MIC頭孢洛林能不同程度上調(diào)MRSA菌株的icaA基因表達(dá)。

與空白對照比較，aP<0.05

3 討論

頭孢洛林對MRSA菌株的青霉素結(jié)合蛋白PBPs具有較強(qiáng)的親和力，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而使細(xì)菌死亡，但是頭孢洛林對青霉素結(jié)合蛋白PBP2a有更高的親合力[11-12],且有廣譜抗菌活性。在本研究中，MRSA菌株對大多數(shù)抗菌藥物均具有較高的耐藥性，而對萬古霉素、呋喃妥因和頭孢洛林完全敏感。這與文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]基本一致。呋喃妥因雖然在體外具有穩(wěn)定的抗菌活性，但腸道吸收量少，在血液和體內(nèi)達(dá)不到有效治療濃度，大部分藥物以原形從尿中排出，主要用于預(yù)防和治療下尿路感染疾病。萬古霉素具有腎毒性等不良反應(yīng)，在臨床治療MRSA感染時應(yīng)慎重使用。本研究中所用金黃色葡萄球菌對頭孢洛林全部敏感，且具有較低的MIC，說明頭孢洛林為金黃色葡萄球菌耐藥株的感染治療提供了一個新的治療選擇。

表2 亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株胞外多糖的影響

注：與空白對照組比較，aP<0.05,bP<0.01

金黃色葡萄球菌是生物膜感染的常見病原菌。形成生物膜的細(xì)菌具有高度的耐藥性并能逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。由于在給藥方案的開始和結(jié)束、劑量之間以及低劑量連續(xù)治療中，細(xì)菌均處于亞-MIC抗菌藥物環(huán)境下[15]，因此研究亞-MIC抗菌藥物對細(xì)菌的影響具有重要的臨床研究意義。本研究顯示亞-MIC頭孢洛林對大部分MRSA菌株的生物膜形成能力具有誘導(dǎo)作用，這與亞-MIC β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素和利奈唑胺等抗菌藥物對金黃色葡萄球菌生物膜形成作用結(jié)果一致[6,16]。提示不同種類亞-MIC抗菌藥物在體外均可誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌生物膜的形成，影響細(xì)菌感染的病程。

葡萄球菌icaA屬于糖基轉(zhuǎn)移酶，是生物膜內(nèi)主要成分多糖合成的關(guān)鍵酶[17]。本研究結(jié)果顯示亞-MIC頭孢洛林對MRSA菌株胞外多糖和icaA基因的表達(dá)均有誘導(dǎo)作用。提示頭孢洛林可能通過誘導(dǎo)icaA基因的高表達(dá)導(dǎo)致胞外多糖產(chǎn)生的增多，進(jìn)而使細(xì)菌生物膜的形成能力增加。然而，頭孢洛林等小分子藥物極少可直接調(diào)控icaA基因的表達(dá)，其具體的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。頭孢洛林雖對MRSA浮游菌具有較好的抗菌活性，但是在亞-MIC條件下可誘導(dǎo)細(xì)菌生物膜的形成，因此臨床治療過程中應(yīng)根據(jù)藥物的代謝特點(diǎn)，盡量避免或減少細(xì)菌處于亞-MIC的時間。該研究為臨床抗菌藥物的合理使用提供了理論依據(jù)，豐富了抗感染理論。

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Effect of sub-minimal inhibitory concentration ceftaroline on the biofilm formation of methicillin-resistant staphylococcus aureus isolates

ZhuKe*,SongJie,LiuYawei,SunFengjun,XuQiaoling

(*DepartmentofPreventionandHealthCare,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Correspondingauthor:XuQiaoling，Email:fengwei.sky@163.com

Objective To investigate the effect of sub-minimal inhibitory concentration (sub-MIC) ceftaroline on the biofilm formation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates and provide the theory support for clinical treatment of antibiotics.Methods The MICs of anitibiotics to MRSA isolates were detected by broth microdilution method.The effect of sub-MIC ceftaroline on the biofilm formation of MRSA isolates was determined by using 96-crystal violet staining.The production of extracellular polymeric substances was detected by phenol-sulfuric acid method.The expression of icaA gene was analyzed by Real-Time PCR amplification.Results Ten MRSA strains were high resistant to most of the tested antibiotics,whereas they were all sensitive to nitrofurantoin,vancomycin and ceftaroline.Sub-MIC ceftaroline could significantly induce the biofilm formation of seven MRSA strains.In addition,sub-MIC ceftaroline could increase the production of extracellular polymeric substances and icaA gene expression of MRSA strains.Conclusions Sub-MIC ceftaroline might increase the production of extracellular polymeric substances by inducing the icaA gene expression,and then result in the enhancement of MRSA biofilm formation.

Methicillin-resistant staphylococcus aureus；Biofilms；Microbial sensitivity tests；Ceftaroline

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373451)

朱科,醫(yī)師,Email:21420019@qq.com

徐巧玲，副主任藥師，Email:fengwei.sky@163.com

R378.11

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.04.008

2017-02-18)