李 偉 卓召振 李榮輝 袁 軍

(貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴陽550002)

激活TLR5和NLRC4通路的重組鞭毛素蛋白對不同乳腺癌細(xì)胞系增殖的抑制作用①

李 偉 卓召振②③李榮輝③袁 軍③

(貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴陽550002)

目的：探究激活TLR5和NLRC4通路的重組鞭毛素蛋白對不同乳腺癌細(xì)胞系增殖的抑制作用。方法：表達(dá)和純化重組鞭毛素蛋白即全長鞭毛素蛋白FliC(同時(shí)激活TLR5和NLRC4兩條通路)、FliCΔ90-97(不能激活TLR5通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4通路)和FliCΔ90-97:L3A(兩條通路都不激活)。用不同濃度的重組鞭毛素蛋白刺激MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞，72 h后，利用CCK8法檢測其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并計(jì)算抑制率。軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)：每孔細(xì)胞數(shù)為1 000個(gè)MCF-7細(xì)胞鋪于6孔板中，重組鞭毛素蛋白濃度為1 μg/ml，培養(yǎng)14 d后，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。結(jié)果：四種鞭毛素蛋白在0.1 μg/ml的濃度刺激下，對MCF-7細(xì)胞的抑制率達(dá)到30%,FliCΔ90-97對MCF-7的抑制作用是劑量依賴的。在1 μg/ml時(shí)單獨(dú)激活TLR5的FliC-L3A鞭毛素蛋白的抑制率高于全長的FliC和單獨(dú)激活NLRC4的FliCΔ90-97。FliCΔ90-97:L3A也對MCF-7細(xì)胞有抑制作用。四種鞭毛素蛋白對MDA-MB-231細(xì)胞在加轉(zhuǎn)染試劑之后才表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。結(jié)論：鞭毛素蛋白可以抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是由于分別激活胞膜和胞內(nèi)的除TLR5和 NLRC4以外的其他通路。

鞭毛素蛋白；TLR5；NLRC4；乳腺癌細(xì)胞

乳腺癌居女性惡性腫瘤第一位，已成為嚴(yán)重威脅女性健康和生命的殺手，對乳腺癌的治療同其他腫瘤一樣尚面臨許多難題。越來越多的證據(jù)表明，TLRs在癌癥進(jìn)展中起著重要作用[1-4]。TLR4能夠保護(hù)腫瘤細(xì)胞抵御免疫攻擊，促進(jìn)腫瘤生長[5]，而激活TLR3則能夠促進(jìn)乳腺癌和黑色素瘤的增殖[6]。因此，不同的腫瘤細(xì)胞中的TLRs的功能和生物學(xué)活性是不同的。

鞭毛素是細(xì)菌鞭毛的重要構(gòu)成組件，也是一種重要的PAMPs。鞭毛素蛋白作為TLR5的天然配體，激活TLR5介導(dǎo)的信號(hào)通路，啟動(dòng)促炎基因的表達(dá)。同時(shí)可以被胞內(nèi)的NAIP5/NLRC4識(shí)別，能夠激活Caspase-1并釋放成熟的IL-1β和IL-18，同時(shí)引起細(xì)胞的凋亡。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)不同乳腺癌細(xì)胞系都表達(dá)TLR5和NLRC4，MCF-7細(xì)胞TLR5和NLRC4表達(dá)高于其他乳腺癌細(xì)胞系。而且文獻(xiàn)報(bào)道鞭毛素蛋白可以通過激活乳腺癌細(xì)胞上的TLR5抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7]，NLRC4炎癥小體在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8]。鞭毛素蛋白能夠通過TLR5通路的激活增強(qiáng)腫瘤特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答[9]。然而有研究發(fā)現(xiàn)鞭毛素蛋白注射體內(nèi)可以抑制也可以促進(jìn)腫瘤的生長[10,11]。那么鞭毛素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖是否只通過TLR5通路？NLRC4通路的激活對TLR5通路介導(dǎo)的腫瘤抑制作用是否有影響？目前并無相關(guān)研究報(bào)道。

本研究利用重組鞭毛素蛋白同時(shí)或者單獨(dú)激活TLR5和NLRC4通路，探討了重組鞭毛素蛋白通過TLR5和NLRC4通路對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的抑制作用，為深入了解鞭毛素蛋白對不同乳腺癌細(xì)胞的抑制機(jī)制和利用鞭毛素蛋白進(jìn)行抗腫瘤治療具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和細(xì)胞系 CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(日本同仁)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)；氨芐青霉素和鏈霉素(北京索萊寶公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone)；MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞購自武漢博士德公司，表達(dá)菌株FliC、FliC-L3A、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A由中國科學(xué)院武漢病毒所鄢慧民研究員惠贈(zèng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)：MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，每隔3～5 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)，收獲細(xì)胞備用。

1.2.2重組鞭毛素蛋白的表達(dá)和純化及活性檢測 方法見參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn) 用去離子水分別配制1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖溶液，高壓滅菌后，置于40℃中不會(huì)凝固。按1∶1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3 ml混合液注入直徑6 cm平皿中，冷卻凝固可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。按1∶1比例在無菌試管中混合0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2 ml的細(xì)胞懸液，并加入鞭毛素蛋白，使其終濃度為1 μg/ml，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，形成雙瓊脂層，待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)14 d。結(jié)晶紫染色后，把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算形成率。

1.2.4CCK8檢測細(xì)胞增殖 梯度配制鞭毛素蛋白，使其濃度為0.1、1、10 μg/ml，梯度稀釋時(shí)候要充分渦旋混勻，注意無菌操作。

充分吹散細(xì)胞，混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2.5×104ml-1，然后相應(yīng)鞭毛素蛋白孔加入100 μl，即每孔細(xì)胞數(shù)為2 500個(gè)，加四種重組鞭毛素蛋白(1 μg/ml)刺激，培養(yǎng)70 h，CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況。37℃，5%CO2培養(yǎng)70 h吸出多余培養(yǎng)基，使剩余體積為100 μl。然后每孔加入10 μl的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。測定450 nm每孔OD值，根據(jù)公式計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(未處理照組-空白)-(處理組-空白)/(未處理組-空白)×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所得結(jié)果的比較采用One-way ANOVA和T檢驗(yàn)共同分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CCK8法檢測不同濃度的重組鞭毛素蛋白對MCF-7細(xì)胞的抑制作用 四種鞭毛素蛋白在0.1 μg/ml的濃度下，對MCF-7細(xì)胞的抑制率達(dá)到30%,FliCΔ90-97對MCF-7的抑制作用是劑量依賴的。在1 μg/ml時(shí)單獨(dú)激活TLR5的FliC-L3A鞭毛素蛋白的抑制率高于全長的FliC和單獨(dú)激活NLRC4的FliCΔ90-97。雖然FliCΔ90-97：L3A不激活TLR5和NLRC4兩條通路，但是對乳腺癌MCF-7細(xì)胞仍有抑制作用(圖1)。

2.2軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測重組鞭毛素蛋白對MCF-7細(xì)胞的抑制作用 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中，全長FliC對MCF-7的抑制作用最明顯，克隆形成率僅為3.3%，對照組克隆形成率為7.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其次是FliC-L3A和FliCΔ90-97。FliCΔ90-97：L3A也對MCF-7細(xì)胞有抑制作用(圖2 A、B)。

2.3CCK8法檢測不同濃度的重組鞭毛素蛋白對MDA-MB-231細(xì)胞的直接抑制作用 無轉(zhuǎn)染試劑處理，四種重組鞭毛素蛋白與MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)70 h，抑制率與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.4加入轉(zhuǎn)染試劑后鞭毛素蛋白抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖 我們先前的研究發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞TLR5在胞質(zhì)內(nèi)，對鞭毛素刺激無反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)加入轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000，使重組鞭毛素蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入轉(zhuǎn)染試劑后，各重組鞭毛素蛋白均對MDA-MB-231出現(xiàn)很明顯的抑制作用，而且呈濃度依賴性。10 μg/ml濃度的FliC和FliCΔ90-97對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率均高于0.1 μg/ml和1 μg/ml(P<0.001)。在相同濃度下,各重組鞭毛素蛋白對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率無明顯差異(圖4)。

圖1 重組鞭毛素蛋白抑制MCF-7細(xì)胞的增殖Fig.1 Recombinant flagellin inhibit proliferation of MCF-7

圖2 MCF-7細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

圖3 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞對鞭毛素蛋白無反應(yīng)Fig.3 MDA-MB-231 breast cancer cells has no response to flagellin

圖4 加入轉(zhuǎn)染試劑后鞭毛素蛋白抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖Fig.4 Recombinant flagellin inhibit prolifration of MDA-MB-231 after adding transfection reagent Lipo2000Note: ***.P<0.001.

3 討論

鞭毛素蛋白是TLR5和NLRC4受體的配體，能夠激活機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)來抵御病原菌的入侵，而最近的研究表明TLR5和NLRC4受體的激活可能影響著腫瘤的形成和發(fā)展。先前的研究表明TLR5激動(dòng)劑鞭毛素蛋白可能具有直接抑制腫瘤的功能[13,14]，鞭毛素蛋白和表達(dá)鞭毛蛋白的細(xì)菌在小鼠模型中表現(xiàn)了其抗腫瘤效果。目前，對鞭毛素蛋白是否只通過TLR5通路抑制不同乳腺癌細(xì)胞系增殖以及NLRC4通路的激活對TLR5通路介導(dǎo)的腫瘤抑制作用是否有影響并不十分清楚。

我們先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不同乳腺癌細(xì)胞系都表達(dá)TLR5和NLRC4受體，但是表達(dá)部位和表達(dá)水平存在差異，其中MCF-7細(xì)胞系中TLR5和NLRC4受體表達(dá)高于其他細(xì)胞系。本研究通過利用分別激活TLR5和NLRC4通路的重組鞭毛素蛋白刺激不同的乳腺癌細(xì)胞系，來探討這兩條通路的激活對乳腺癌細(xì)胞系的直接抑制作用的差異。采用CCK8檢測細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，在MCF-7細(xì)胞四種重組鞭毛素蛋白均可以抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，四種蛋白在相同濃度條件下抑制率接近。

MDA-MB-231細(xì)胞對鞭毛素蛋白直接刺激沒有反應(yīng)，但是在轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000存在下，四種鞭毛素蛋白均可以對其產(chǎn)生抑制效應(yīng)，且呈現(xiàn)濃度依賴性。而重組鞭毛素蛋白可以直接抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，這可能是由于MCF-7細(xì)胞系中TLR5受體在胞漿和胞膜上均有表達(dá)，而MDA-MB-231細(xì)胞系中只在胞漿中表達(dá)。重組鞭毛素蛋白對乳腺癌細(xì)胞的抑制情況跟TLR5和NLRC4通路的激活沒有明顯的相關(guān)性，所以可能其抑制效應(yīng)除了TLR5和NLRC4的激活之外，還存在其他效應(yīng)機(jī)制。這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的鞭毛素蛋白通過TLR5信號(hào)通路抑制乳腺癌并不完全一致。

那么，除了TLR5和NLRC4通路外是否還存在其他的通路？鞭毛素蛋白高變區(qū)和保守區(qū)在抑制乳腺癌細(xì)胞系增殖中是否存在差異？我們需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討鞭毛素蛋白抑制乳腺癌細(xì)胞系增殖的機(jī)制。

[1] Kluwe J,Mencin A,Schwabe RF.Toll-like receptors,wound healing,and carcinogenesis[J].J Mol Med (Berl),2009,87(2):125-138.

[2] Rakoff-Nahoum S,Medzhitov R.Toll-like receptors and cancer[J].Nat Rev Cancer,2009,9(9):57-63.

[3] Matijevic T,Pavelic J.Toll-like receptors:cost or benefit for cancer?[J].Curr Pharm Des,2010,16(9):1081-1090.

[4] Pinto A,Morello S,Sorrentino R.Lung cancer and Toll-like receptors[J].Cancer Immunol Immunother,2011,60(9):1211-1220.

[5] Szczepanski MJ,Czystowska M,Szajnik M,etal.Triggering of Toll-like receptor 4 expressed on human head and neck squamous cell carcinoma promotes tumor development and protects the tumor from immune attack[J].Cancer Res,2009,69(7):3105-3113.

[6] Salaun B,Coste I,Rissoan MC,etal.TLR3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells[J].J Immunol,2006,176(8):4894-4901.

[7] Shi M,Yao Y,Han F,etal.MAP1S controls breast cancer cell TLR5 signaling pathway and promotes TLR5 signaling-based tumor suppression[J].PLoS One,2014,9(9):e86839.

[8] Hu B,Elinav E,Huber S,etal.Inflammation-induced tumorigenesis in the colon is regulated by caspase-1 and NLRC4[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(50):21635-21640.

[9] Nguyen CT,Hong SH,Sin JI,etal.Flagellin enhances tumor-specific CD8(+) T cell immune responses through TLR5 stimulation in a therapeutic cancer vaccine model[J].Vaccine,2013,31(37):3879-3887.

[10] Sfondrini L,Rossini A,Besusso D,etal.Antitumor activity of the TLR-5 ligand flagellin in mouse models of cancer[J].J Immunol,2006,176(11):6624-6630.

[11] Garaude J,Kent A,van Rooijen N,etal.Simultaneous targeting of toll-and nod-like receptors induces effective tumor-specific immune responses[J].Sci Transl Med,2012,4(120):120ra116.

[12] Xiao Y,Liu F,Yang J,etal.Over-activation of TLR5 signaling by high-dose flagellin induces liver injury in mice[J].Cell Mol Immunol,2015,12(6):729-742.

[13] Rhee SH,Im E,Pothoulakis C.Toll-like receptor 5 engagement modulates tumor development and growth in a mouse xenograft model of human colon cancer[J].Gastroenterology,2008,135(2):518-528.

[14] Cai Z,Sanchez A,Shi Z,etal.Activation of Toll-like receptor 5 on breast cancer cells by flagellin suppresses cell proliferation and tumor growth[J].Cancer Res,2011,71(7):2466-2475.

[收稿2016-12-28]

(編輯 張曉舟)

ImpactofTLR5andNLRC4activationonproliferationofdifferentbreastcancercelllines

LIWei,ZHUOZhao-Zhen,LIRong-Hui,YUANJun.CentralLaboratory,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang550002，China

Objective:To explore the impact of TLR5 and NLRC4 activation on the proliferation of different breast cancer cell lines,MCF-7 and MDA-MB-231.Methods:Induction,expression,purification and identification of recombiant flagellin,including FliC (activating both TLR5 and NLRC4),FliCΔ90-97(unable to activate TLR5),FliC-L3A (unable to activate NLRC4),FliCΔ90-97:L3A (unable to activate both TLR5 and NLRC4).Using different concentration of recombinant flagellin to stimulate MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines,72 h later,the proliferation of tumor cells were detected with CCK8.We also used soft AGAR forming experiments to detect the inhibition ratio of recombinant flagellin on breast cancer cell lines.Briefly,1 000 cells were plated in the 6-well plate,then stimulated with 1 μg/ml recombinant flagellin,14 days later,the number of cloning were counted after crystal violet staining.Results:After stimulation with four recombinant flagellins at the concentration of 0.1 μg/ml,the inhibition ratio on MCF-7 reached 30%,and FliCΔ90-97 were dose-dependent on the inhibition of MCF-7 proliferation.At the concentration of 1 μg/ml,FliC-L3A which only activated TLR5 showed stronger inhibition ratio than FliC.FliCΔ90-97:L3A which did not activate both TLR5 and NLRC4 also inhibited the proliferation of MCF-7.After adding transfection reagent,four recombinant flagellins showed inhibition effect on MDA-MB-231.Conclusion:Flagellin can inhibit the proliferation of MCF-7 and MDA-MB-231,and the mechanism of inhibition on the proliferation were not TLR5 and NLRC4 pathway dependent.There might exist new mechanisms to explain this phenomenon.

Flagellin;TLR5;NLRC4;Breast cancer cell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.013

①本文受貴州省衛(wèi)計(jì)委科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(gzwjkj2015-1-020)、貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合LH字[2015]7167號(hào))、貴州省科技廳科學(xué)基金(黔科合基礎(chǔ)[2016]1093)和貴州省人民醫(yī)院博士基金(GZSYBS[2015]11號(hào))資助。

②并列第一作者。

③貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽550002。

李 偉(1983年-)，男，博士，主要從事腫瘤免疫方面的研究，E-mail:lwcy2010@yeah.net。

及指導(dǎo)教師：袁 軍(1970年-)，女，博士，教授，主要從事器官移植和腫瘤免疫方面的研究，E-mail：junyuan99430@163.com。

R730.5

A

1000-484X(2017)06-0869-04