榮 燕 江智霞 黃大可

(安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥230012)

氣道吸入中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑對顱腦損傷誤吸致肺損傷大鼠炎性因子及免疫功能的影響

榮 燕 江智霞①黃大可②

(安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥230012)

顱腦損傷(Brain injury)患者咽反射消失，食物或口咽分泌物容易誤吸進入肺內(nèi)，導(dǎo)致急性吸入性肺損傷(Acute lung injury,ALI)，處理不及時還可能出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，甚至造成患者死亡[1]。目前顱腦損傷繼發(fā)肺損傷發(fā)病機制尚不明確，可能與活化中性粒細胞(Polymorphonulear leukocyte,PMN)釋放細胞因子與過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)是PMN釋放的一種蛋白酶，是引起炎癥反應(yīng)與免疫異常的終效因子，可介導(dǎo)并引起肺損傷[2]。西維來司鈉(Sivelestat sodiom)是一種中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)抑制劑，可以有效抑制NE，阻止并減輕中性粒細胞介導(dǎo)的肺損傷反應(yīng)[3]。西維來司鈉臨床上多采用全身靜脈給藥，局部藥物濃度有限，給藥劑量大，藥物作用受限，且副作用明顯。霧化吸入能使藥物直接到達終末支氣管及肺泡，局部藥物濃度高，能最大程度發(fā)揮藥效[4]。本文通過動物實驗研究的方法，探討霧化吸入西維來司鈉對顱腦損傷誤吸致肺損傷大鼠模型炎性因子、免疫功能的影響，旨在揭示其治療的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 60只SD大鼠，均為雄性，體重270～340 g，平均(312.53±7.89)g。購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心(許可證號：AHCK2015-0012)，采用隨機數(shù)字表法分為健康對照組、模型組、生理鹽水組、地塞米松組、西維來司鈉組各12只。飼養(yǎng)條件：室溫(25.21±0.56)℃，相對濕度50%～60%，常規(guī)進食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行試驗。

1.1.2主要儀器與試劑 霧化治療器：德國百瑞公司PARI Turbo BOY 型；高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-16型；光學(xué)相差顯微鏡：日本Olympus公司CKX41型；病理圖像分析系統(tǒng)：Germany公司Leica Qwin standard 2.8；恒溫冰箱：天津泰斯特儀器有限公司HH-W21-60型；全自動生化分析儀：日本日立7600型；流式細胞式：貝克曼庫爾特Gallios型。

西維來司鈉：上海巨龍藥物研究開發(fā)有限公司，批號：20151210；NE、IL-8、IL-4、IFN-γ、趨化因子CCL3、趨化因子CCL5等試劑均購于北京晶美生物工程有限公司；BALF白蛋白試劑購自海德診斷系統(tǒng)有限公司。

1.2方法

1.2.1顱腦損傷誤吸致肺損傷模型 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，除健康對照組外，其余四組大鼠采用改進型Marmarou法建立顱腦損傷大鼠模型：將大鼠頭部置BI裝置的導(dǎo)引下，用100 g的撞擊錘從50 cm 高處經(jīng)引導(dǎo)管下滑，致使大鼠重度腦損傷。見大鼠有呼吸抑制、肢體抽蓄、昏迷及肢體活動障礙為重度腦損傷造模成功。

隨后向大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛0.33 mg/kg，麻醉大鼠后，將其仰臥固定于操作臺上，常規(guī)消毒后，切開頸部皮膚表層，分離氣管，頭向下傾斜30°，將提前收集的鼻飼患者的胃液(0.4 ml/kg)經(jīng)大鼠氣管滴入，建立顱腦損傷誤吸模型，大鼠逐層縫合后歸籠。

1.2.2分組試驗 參考權(quán)明桃等[5]方法，顱腦損傷誤吸模型建立后，除重度腦損傷組大鼠不作處理外，其余3組大鼠分別置入30 cm×15 cm×20 cm的玻璃箱中，給予不同的藥物溶液霧化吸入。地塞米松組用地塞米松6.25 mg/kg+0.9%氯化鈉10 ml霧化吸入，西維來司鈉組用西維來司鈉1.25 mg/kg+0.9%氯化鈉10 ml霧化吸入，每次20 min，3次/d，連續(xù)治療3 d。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1NE、IL-8及白蛋白含量 治療3 d 后，于氣管下段作“T”形切口，將5 ml預(yù)冷生理鹽水緩慢注入肺內(nèi)，反復(fù)灌洗5次，取支氣管肺泡灌洗液(BALF)5 ml，3 000 r/min離心15 min取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測NE、IL-8含量，采用免疫透射比濁法測定BALF中白蛋白濃度。

1.2.3.2γ-IFN、IL-4、CCL3及CCL5含量 治療3 d 后，經(jīng)腹主動脈取血6 ml，3 000 r/min離心10 min取血清，采用ELISA法測定IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量。

2 結(jié)果

2.1NE、IL-8及白蛋白含量比較 模型組NE、IL-8、白蛋白含量明顯高于健康對照組(P<0.05,P<0.01)；地塞米松組、西維來司鈉組NE、IL-8、白蛋白含量明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01)；西維來司鈉組NE、IL-8、白蛋白含量明顯低于地塞米松組(P<0.05)。見表1。

2.2IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量比較 模型組血清IFN-γ、CCL3、CCL5含量明顯高于健康對照組，IL-4含量明顯低于健康對照組(P<0.05,P<0.01)；西維來司鈉組、地塞米松組血清IFN-γ、CCL3、CCL5含量明顯低于模型組，IL-4含量明顯高于模型組(P<0.05,P<0.01)；且西維來司鈉組、地塞米松組血清IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

急性肺損傷是重度腦損傷的常見并發(fā)癥，常發(fā)展為ARDS導(dǎo)致患者呼吸衰竭甚至死亡。重型顱腦損傷后繼發(fā)吸入性肺炎的發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前認為與肺內(nèi)過度性、失控性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞廣泛破壞有關(guān)[6]。

嚴重顱腦損傷后，應(yīng)激反應(yīng)及顱內(nèi)壓升高等因素，引起交感神經(jīng)興奮，全身血管收縮，組織缺血缺氧，使中性粒細胞處于激活狀態(tài)；如因誤吸再次發(fā)生急性肺損傷，則使處于激活狀態(tài)的炎性細胞釋放大量的炎性介質(zhì)，其中NE可直接降解細胞外基質(zhì)的多種蛋白成分，增加血管通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生趨化性細胞因子，使IL-8等大量釋放，引起過度失控的炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致ALI的發(fā)生[7]。大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊療法是治療ALI的主要方法。地塞米松具有廣泛的抗炎作用，能降低肺泡-毛細血管的通透性，減少滲出，降低INF-α、白介素類炎性因子的水平，抑制炎性反應(yīng)，減輕肺損傷。西維來司鈉是一種NE抑制劑，在炎癥局部可有效抑制彈性蛋白酶，減輕肺組織損傷[8]。通過霧化吸入可使藥物直達肺泡，能減輕ALI肺部炎性因子、PMN的活化，減少炎性反應(yīng)對肺組織的直接損傷[9]。丁云麗等[10]認為，西維來司鈉能明顯抑制ANP肺損傷大鼠促炎細胞因子的釋放和表達，有效保護急性胰腺炎肺損傷。王一賀等[11]發(fā)現(xiàn)，西維來司鈉保護肺組織的機制是通過改善血氣分析指標(biāo)、減輕肺水腫、降低血清中炎癥因子水平實現(xiàn)的。本文研究中，西維來司鈉組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中NE、IL-8、白蛋白含量明顯低于模型組與地塞米松組，與上述文獻報道結(jié)論基本相似。

表1 各組大鼠BALF中NE、IL-8及白蛋白含量的比較

Note：Compared with health control group，t=10.728-31.107,1)P<0.01；compared with model group，t=4.204-26.179,2)P<0.05；compared with Dexamethasone group，t=3.799-8.634,3)P<0.05.

表2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量的比較

Note：Compared with health control group，t=10.728-31.107,1)P<0.01；compared with model group，t=4.204-26.179,2)P<0.05；compared with Dexamethasone group，t=3.799-8.634,3)P<0.05.

“二次打擊”理論認為，當(dāng)機體受到第一次打擊時，炎性因子與免疫細胞均處于激活狀態(tài)，如果再次受到第二次打擊，將會使處于激活狀態(tài)的炎性細胞大量釋放，免疫功能降低[12]。顱腦損傷所致誤吸對肺組織的第二次打擊，既往多認為是胃液酸性物質(zhì)與消化酶對肺組織的直接損傷，隨著研究的不斷深入，誤吸不僅直接導(dǎo)致肺毛細血管通透性增加，也造成肺內(nèi)炎性細胞因子過度分泌，導(dǎo)致免疫功能紊亂[13，14]。T淋巴細胞參與機體的免疫調(diào)節(jié)。CD4+細胞主要分為Th1、Th2細胞兩類，IFN-γ主要由Th1細胞分泌，能調(diào)節(jié)中性粒細胞募集，是一種促炎因子；IL-4由Th2分泌，能抑制IFN-γ分泌，發(fā)揮強大的抗炎作用[15]。CCL3及CCL5均為趨化因子之一，能調(diào)節(jié)并活化正常T細胞的表達與分泌，從而參與機體的免疫過程[16]。周游等[17]對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型大鼠的研究中，報道西維來司鈉可增強自身免疫性腦脊髓炎模型大鼠血清IL-4含量，且呈劑量依賴性關(guān)系。本文研究表明，西維來司鈉外周血中IFN-γ、CCL3及CCL5含量明顯低于模型組，IL-4含量明顯高于模型組，提示西維來司鈉可能提高調(diào)節(jié)機體免疫功能來發(fā)揮抗炎效果。

本文研究結(jié)果表明，西維來司鈉氣道霧化吸入治療對顱腦損傷誤吸致肺損傷大鼠肺組織有一定的保護作用，可能與抑制中性粒細胞彈性蛋白酶活性、減少炎性細胞浸潤、調(diào)節(jié)機體免疫功能等因素有關(guān)。需要指出的是，本文僅為實驗性研究，缺乏對不同劑量西維來司鈉霧化吸入治療的比較，且對可能作用機制分析不夠深入，更準確的結(jié)論還有待于更多的基礎(chǔ)研究與臨床研究去求證。

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[收稿2017-01-06]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.023

①遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遵義563003。

②安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥230000。

榮 燕(1982年-)，女，碩士，講師，主要從事醫(yī)學(xué)教育方面的研究，E-mail：409078107@qq.com。

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1000-484X(2017)06-0919-03