劉行仁 白義鳳 梁 良 馮 靜 鄧 菲

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院呼吸科，成都610072)

紫蘇醇對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用機(jī)制的研究①

劉行仁 白義鳳②梁 良②馮 靜③鄧 菲④

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院呼吸科，成都610072)

目的：探討紫蘇醇(Perillyl alcohol,PA)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用機(jī)制，并闡明其對(duì)腫瘤血管生成信號(hào)的影響。方法：不同濃度PA和厄洛替尼加入到A549細(xì)胞中，利用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法測定藥物組對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用，Transwell法檢測PA對(duì)A549細(xì)胞侵襲的抑制作用，采用間接熒光標(biāo)記法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的變化；分光光度法檢測PA對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3活性的影響，Western blot法檢測A549中VEGF、HIF-1α及COX-2的表達(dá)，凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)測定A549細(xì)胞中NF-κB活性。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，隨著濃度的增加(10、50、100 μg/ml)，PA和厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞生長的抑制率在不斷地增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A549細(xì)胞侵襲能力呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A549細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨厄洛替尼濃度的增加變化不大，而ROS水平隨著PA的濃度的增加而增加，在100 μg/ml濃度的PA下引起的ROS百分率達(dá)到了(80.43±6.92)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，隨著PA和厄洛替尼濃度的增加和作用時(shí)間的延長，A549細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase-3活性明顯增加(P<0.05)，隨著紫蘇醇濃度的增加，COX-2、VEGF和HIF-1α的表達(dá)呈不斷降低的趨勢，EMSA檢測結(jié)果顯示，隨著PA濃度的增加，NF-κB的條帶面積不斷減少。結(jié)論：PA可能參與并促進(jìn)了ROS的生成和Caspase-3活性增加，最終誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，PA可能通過降低NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)COX-2、VEGF等的表達(dá)減少，使血管生成滯后，能夠有效地使細(xì)胞的穿透能力下降和凋亡發(fā)生。

紫蘇醇；肺癌A549細(xì)胞；增殖抑制作用；活性氧(ROS)水平；Caspase-3活性；血管生成信號(hào)通路

劑量、療效和藥物毒性等因素在肺癌常規(guī)的放化療方案上已累積達(dá)到了極限，人們往往急需尋求低毒、高效性的作用機(jī)制上有別于現(xiàn)有化療藥物的物質(zhì)，進(jìn)而對(duì)腫瘤產(chǎn)生更強(qiáng)的殺傷力。腫瘤免疫治療在奧地利召開的2015年“歐洲癌癥大會(huì)上成為一個(gè)亮點(diǎn)，核因子NF-κB蛋白家族與多種基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列位點(diǎn)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與免疫、炎癥、應(yīng)激等反應(yīng)，同時(shí)也參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程。NF-κB的激活途徑主要有經(jīng)典途徑和旁路途徑兩條，這兩條途徑的激活最終都是通過磷酸化IκBα蛋白，并解除其對(duì)NF-κB的抑制來實(shí)現(xiàn)，因此NF-κB與慢性炎癥及腫瘤的形成有著至關(guān)重要的關(guān)系。

紫蘇醇 (Perillyl alcohol，PA) 主要以游離態(tài)或酯的形式天然存在于柑橘、櫻桃、薄荷、香檸檬、姜草、雜薰衣草等多種植物中，具有多種生物活性[1]。近年來紫蘇醇作為一種高效、廣譜、低毒的抗癌藥物，已經(jīng)受到廣泛關(guān)注和研究。研究表明，PA對(duì)食管癌[2]、胰腺癌[3]、結(jié)腸直腸癌[4]、卵巢癌和乳腺癌[5]等腫瘤均有預(yù)防和治療作用，李詢等[6]研究了PA體外對(duì)NCI-H1299和A549細(xì)胞的生長和低毒性，李明潺等[7]研究了槐定堿對(duì)肺癌A549 細(xì)胞體外增殖和侵襲抑制作用及機(jī)制的研究，但是相關(guān)的PA抗肺癌A549細(xì)胞機(jī)制沒有進(jìn)行探討，因此，本實(shí)驗(yàn)擬以肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，通過體外和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討PA對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)理，并檢測和探討抗NF-κB血管生成信號(hào)通路的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 人肺癌A549細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 紫蘇醇(高效液相鑒定純度>98%， 含量20 mg)，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，4℃保存，待用。鹽酸厄洛替尼片購自瑞士羅氏有限公司，國藥準(zhǔn)字J20090116；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購買于上海生工生物工程有限公司；小牛血清購買于杭州四季青生物試劑公司；胰蛋白酶、RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；FITC/PI雙染試劑盒購買于碧云天生物試劑公司；活性氧試劑盒購買于美國Sigma公司等。

1.1.3儀器 pHS-3C型酸度計(jì)購自上海雷磁儀器廠；二氧化碳培養(yǎng)箱(RCO3000TVBA)購自美國REVCO公司；流式細(xì)胞儀(FACSAria)購自美國Becton Dikinson公司；酶聯(lián)免疫檢測儀(MULTISKAN MK3)購自芬蘭Labsystems公司；Bio-Rad680型酶聯(lián)檢測儀購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1A549細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)測定 200 μl/孔的對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞(1×105/孔)接種于96孔板中，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入PA和厄洛替尼(10、50、100 μg/ml)培養(yǎng)基，設(shè)定空白對(duì)照組，每個(gè)藥物3個(gè)平行孔。分別培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μl 的5 mg/ml MTT試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后把培養(yǎng)基吸出，加入150 μl 的DMSO試劑，充分振蕩后，充分溶解結(jié)晶，在570 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度(OD)。計(jì)算細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.2A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制能力測定 準(zhǔn)備Transwell小室的濾膜內(nèi)表面涂細(xì)胞外基質(zhì)膠(50 μg/室)。小室干燥后重新加入含有0.1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基水化。4.0 × 105ml-1的重懸浮細(xì)胞在Transwell小室的下室中加入新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)基，而在上室中加入PA和厄洛替尼(10、50、100 μg/ml)培養(yǎng)基組，設(shè)定空白對(duì)照組，每個(gè)藥物3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h，每孔中加入100 μl細(xì)胞懸浮液。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)24 h。取出小室后，使用PBS溶液沖洗濾膜，使用PBS棉棒吸除和擦除上室的細(xì)胞，再根據(jù)Transwell小室使用說明進(jìn)行染色觀察從而計(jì)算穿膜的細(xì)胞數(shù)，從而反映各組細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3A549細(xì)胞內(nèi)ROS檢測 A549細(xì)胞接種后，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別加入PA(10、50、100 μg/ml)的培養(yǎng)基，3個(gè)平行組。加入400 μl DCFH-DA(二氯氫化熒光素，10 μg/ml)，充分混勻后，避光孵育15 min后，用 PBS洗去除細(xì)胞外熒光劑。并用PBS重懸細(xì)胞10 min后對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

1.2.4凋亡蛋白Caspase-3活性的檢測 分析前將Caspase-GlooR3試劑與96孔板置于室溫平衡，選取(10、50、100 μg/ml)濃度的PA處理6、12和24 h 后，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加Caspase-GlooR3試劑，輕輕震蕩30 s，室溫孵育1 h后，用酶標(biāo)儀405 nm處OD值檢測。

1.2.5A549細(xì)胞中VEGF、HIF-1α和COX-2的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的空白對(duì)照組和PA組處理24 h，進(jìn)行各組細(xì)胞總蛋白的提取，通過Bradford的方法調(diào)整相同的蛋白濃度后，進(jìn)行電泳獲得根據(jù)分子量分離的蛋白條帶，根據(jù)pierce公司W(wǎng)estern blot顯像試劑盒的指導(dǎo)說明來進(jìn)行，蛋白的NC膜電轉(zhuǎn)，進(jìn)行蛋白封閉和一抗結(jié)合。本研究一抗包括：大鼠抗人HIF-1α(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000)和COX-2(1∶1 000)多克隆抗體。一抗結(jié)合后洗脫，再進(jìn)行二抗孵育標(biāo)記兔抗大鼠的多克隆抗體(1∶10 000)。ECL試劑盒顯色后，暗室發(fā)光拍照，以β-Actin為內(nèi)參進(jìn)行系統(tǒng)軟件分析。

1.2.6EMSA法測定NF-κB活性 接種2×106ml-1的對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入PA濃度為10、50和100 μg/ml，混合24 h后對(duì)各組細(xì)胞核蛋白進(jìn)行提取，并應(yīng)用購買的試劑盒對(duì)蛋白濃度測定。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)凝膠電泳后，將提取蛋白轉(zhuǎn)移至結(jié)合膜上，并用封閉液對(duì)結(jié)合膜封閉后，加Streptavidin-HRP反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，并用洗滌液洗膜多次，最后用Lighten? HRP底物液進(jìn)行壓片和顯影。

2 結(jié)果

2.1PA對(duì)A549細(xì)胞生長的抑制作用 圖1顯示，不同濃度PA對(duì)A549細(xì)胞生長的抑制曲線，選取10、50、100 μg/ml 3個(gè)濃度作為研究對(duì)象。表1所示，解析PA和厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞生長和侵襲的抑制作用，與空白對(duì)照組比較，隨著PA和厄洛替尼濃度的增加(10、50、100 μg/ml)，PA和厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞生長的抑制率在不斷地增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2PA對(duì)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用 從表1中看出，與空白對(duì)照組相比，隨著PA和厄洛替尼濃度的增大，細(xì)胞侵襲能力呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3PA誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生 用不同濃度PA和厄洛替尼作用A549細(xì)胞48 h 后，表2所示，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨厄洛替尼濃度的增加變化不大，而隨著PA濃度的增加而增加，圖2中細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光隨濃度增加而變多，在100 μg/ml濃度下的PA引起的ROS百分率達(dá)到了(80.43±6.92)%，與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4A549細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3活性檢測 細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，隨著PA和厄洛替尼(10、50、100 μg/ml)濃度的增加和作用時(shí)間的延長，A549細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase-3活性明顯增加(P<0.05)。

圖1 不同濃度PA對(duì)A549細(xì)胞生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PA on growth of A549 cell

2.5A549細(xì)胞中VEGF、HIF-1α和COX-2的表達(dá) 如圖3，在不同濃度紫蘇醇的存在下， 與空白對(duì)照組相比，隨著紫蘇醇濃度的增加，COX-2、VEGF和HIF-1α的表達(dá)呈不斷降低的趨勢。

表1 PA對(duì)A549細(xì)胞生長和侵襲能力的抑制作用

Note：Compared with control group，1)P<0.01；2)P<0.05.

表2 PA對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

Note：Compared with control group，1)P<0.01；2)P<0.05.

圖2 PA對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響Fig.2 Effect of PA on production of ROS in A549 cell

表3 PA對(duì)細(xì)胞Caspase-3活性的影響

Note：Compared with control group，1)P<0.01；2)P<0.05.

圖3 PA對(duì)腫瘤細(xì)胞A549中COX-2、VEGF和HIF-1α表達(dá)的影響Fig.3 Expression of COX-2,VEGF and HIF-1α of PA on A549

圖4 NF-κB 蛋白表達(dá)的 EMSA結(jié)果Fig.4 EMSA result chart of protein expression of NF-κB

2.6PA對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB 活化的調(diào)節(jié) 圖4的EMSA檢測結(jié)果顯示：隨著PA濃度的增加，NF-κB的條帶面積在不斷地減少。

3 討論

信號(hào)通路的下放與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，報(bào)道顯示眾多癌癥預(yù)后不良反應(yīng)均與腫瘤喜好通路有關(guān)[8]，同時(shí)腫瘤組織也會(huì)通過內(nèi)源性因子的調(diào)控促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[9]。因此，阻截信號(hào)通路下放已成為腫瘤靶向治療的重要手段之一。眾所周知，在細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-3和Caspase-9共同組成了酶聯(lián)反應(yīng)的終末因子[10,11]，在腫瘤的凋亡通路中起到開關(guān)作用[12-14]，在PA的存在下，Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)的增加是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要原因，進(jìn)而對(duì)酶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行有效的調(diào)控，能夠使細(xì)胞的穿透能力下降，從而達(dá)到阻礙A549細(xì)胞侵襲的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PA能夠參與并影響Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡通路的活性。

考察了不同濃度的PA對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，發(fā)現(xiàn)PA可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，而ROS是由細(xì)胞內(nèi)氧代謝或外源性氧化劑產(chǎn)生的具有生物活性的氧分子[15,16]，其在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中具有重要作用，而ROS的檢測手段能夠通過DCF熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)厄洛替尼未引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，這和劉曉敏等[17]的研究結(jié)論是一致的，細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān)，此外劉勝姿等[18]也發(fā)現(xiàn)5,7-DMF通過促進(jìn)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧生成從而增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。因此可以說明參與PA并促進(jìn)了ROS誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。隋文文等[19]研究表明，腫瘤在缺氧狀態(tài)下促進(jìn)血管生成因子COX-2、VEGF等的表達(dá)，而缺氧過程中也可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α/HRE的結(jié)合來調(diào)節(jié)COX-2基因的表達(dá)；進(jìn)而參與血管的形成，而以上三種都受NF-κB基因調(diào)控，故NF-κB信號(hào)通路可能就是腫瘤血管生成的主要通路之一，甲基化酶的突變可以造成腫瘤的發(fā)生，而NF-κB信號(hào)通路的活性降低在免疫系統(tǒng)發(fā)育和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生等過程中，起著關(guān)鍵作用。因此PA誘導(dǎo)了ROS水平的升高和NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的降低，會(huì)顯著降低COX-2、VEGF等的表達(dá)，進(jìn)而使血管生成滯后。此外，NF-κB同時(shí)也具有介導(dǎo)免疫應(yīng)答的正常生理功能。機(jī)體受感染后的炎癥反應(yīng)需要啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路，轉(zhuǎn)錄一些細(xì)胞因子來介導(dǎo)免疫應(yīng)答，以清除入侵的病原菌。對(duì)NF-κB的抑制在緩解腫瘤發(fā)生發(fā)展的同時(shí)，也將抑制正常的免疫應(yīng)答，所以如何平衡這兩者的關(guān)系，也是以后必須考慮的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)為肺癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，故PA對(duì)于人肺癌的治療作用還需要進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)。而在分子水平需要進(jìn)行進(jìn)一步的信號(hào)通路基因的檢測，如基因或者微小RNA芯片的檢測，再通過蛋白質(zhì)印跡等手段進(jìn)行進(jìn)一步的基因下游表達(dá)論證。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，PA將作為一種新型的抗肺癌的化療藥物，被進(jìn)一步論證和研究。

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[收稿2016-07-26 修回2016-12-29]

(編輯 張曉舟)

Anti-lungcancereffectandanti-angiogenesistherapystudyofperillylalcohol

LIUXing-Ren，BAIYi-Feng，LIANGLiang，F(xiàn)ENGJing，DENGFei.SichuanAcademyofMedicalScience﹠DepartmentofRespiration,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

Objective:To investigate the inhibitory effect of perillyl alcohol (PA) on the proliferation and invasion of lung cancer cell A549,and the influence of PA on tumor angiogenesis was studied.Methods:Different concentrations of PA and erlotinib were added into lung cancer cell A549,the inhibiting effect of drug group on lung cancer cell A549 was found by MTT assay.The inhibiting effect of PA on lung cancer cell A549 invasion was measured by Transwell assay.ROS changes of PA on lung cancer cell A549 was detected by fluorescent.Influence of PA on Caspase-3 activity of lung cancer cell A549 was measured by spectrophotometry,VEGF,HIF-1α,COX-2 expression in lung cancer cell A549 was measured by Western blot,and the NF-κB activity of lung cancer cell A549 was measured by EMSA.Results:Compared with blank control group,cell growth inhibition rate of PA and erlotinib on lung cancer cell A549 was increasing with the increased concentrations (10，50，100 μg/ml),the difference was statistically significant (P<0.05),the invasion ability of lung cancer cell A549 was decreased continuously,the difference was statistically significant (P<0.05).The ROS level of lung cancer cell A549 had no obvious change with the increasing density of erlotinib,but obviously increased with the increasing concentrations of PA (10，50，100 μg/ml).With the increasing concentrations of PA,the expression of COX-2,VEGF and HIF-1α were continuously decreased.EMSA assay showed that NF-κB was continuously decreased with the increasing concentrations of PA.Conclusion:The antitumor mechanism of PA on lung cancer cell A549 might be related to increase the expression level of ROS and reduce the expression of activity of NF-κB,COX-2,VEGF and HIF-1α with angiogenesis signaling pathway.

Perillyl alcohol;Lung cancer A549 cell;Anti-proliferative effect;ROS level;Caspase-3 activity;Angiogenic signaling pathways

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.011

①本文受國家自然科學(xué)基金(No.81301910)和四川省衛(wèi)計(jì)委科研課題(No.110137)資助。

②四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腫瘤科，成都610072。

③四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院中醫(yī)科，成都610072。

④四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，成都610072。

劉行仁(1980年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肺部感染及肺部腫瘤治療研究，E-mail：syyliudoc@sina.com。

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1000-484X(2017)06-0859-05