馮沛然 黃建芳 王敏珍 廖偉聰 郝代玲 向軍儉

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510632)

抗人PD-L1單克隆抗體的制備及其應(yīng)用①

馮沛然 黃建芳 王敏珍②廖偉聰 郝代玲 向軍儉

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510632)

目的：獲得能應(yīng)用于臨床診斷以及阻斷PD-L1與PD-1結(jié)合的抗人PD-L1單克隆抗體。方法：采用重組表達(dá)的人PD-L1蛋白免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌抗人PD-L1單抗的陽(yáng)性細(xì)胞株，ELISA方法鑒定抗體的特異性、親和力、亞型等方面特性；免疫印跡、間接免疫熒光方法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗體阻斷活性。結(jié)果：共獲得2株抗人PD-L1單抗，抗體效價(jià)分別為1∶2.56×106和1∶3×105，親和力分別為1.5×109L/mol和2.5×108L/mol，均與PD-L2蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。免疫印跡、間接免疫熒光證實(shí)抗體有診斷作用。殺傷實(shí)驗(yàn)顯示抗體有阻斷作用。結(jié)論：共獲得兩株穩(wěn)定分泌高效價(jià)、高特異性的抗人PD-L1單抗的雜交瘤細(xì)胞株，能作為診斷抗體應(yīng)用于腫瘤表型檢測(cè)和預(yù)后有效性的評(píng)估?？贵w的阻斷功能可應(yīng)用于聯(lián)合CIK細(xì)胞免疫治療。

PD-L1；單克隆抗體；流式細(xì)胞術(shù)；CIK細(xì)胞；腫瘤診斷

程序性細(xì)胞死亡配體(Programmed cell death ligand-1，PD-L1)也稱B7-H1、CD274，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞表面。PD-L1與表達(dá)于活化T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后可向T細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞的功能。在腫瘤抗機(jī)體免疫中，腫瘤組織異常高表達(dá)PD-L1，通過(guò)與PD-1結(jié)合抑制CTL對(duì)其的殺傷，PD-1/PD-L1通路與免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答息息相關(guān)。Francisco等[1]發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1分子，其通過(guò)PD-1/PD-L1執(zhí)行其免疫調(diào)節(jié)作用。當(dāng)PD-1與APC細(xì)胞上的PD-L1結(jié)合后可抑制CD8+T細(xì)胞的活化，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的活化，從而對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。Dong等[2]制備出抗人B7-H1的單克隆抗體，通過(guò)流式免疫熒光標(biāo)記方法檢測(cè)B7-H1主要高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞而非正常組織，并通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的B7-H1的表達(dá)能增加CTL細(xì)胞的凋亡，而阻斷PD-1/PD-L1通路恢復(fù)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。Castella等[3]在多發(fā)性骨髓瘤患者(MM)骨髓中的Vγ9Vδ2-T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其PD-1異常高表達(dá)，首次報(bào)道PD-1在腫瘤區(qū)域中Vγ9Vδ2-T細(xì)胞中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)MM患者BM中Vγ9Vδ2-T細(xì)胞經(jīng)過(guò)PD-1治療后增長(zhǎng)率提高了2倍，細(xì)胞毒性提高了5倍。Khan等[4]還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PD-L1的B細(xì)胞能抑制B細(xì)胞的體液免疫功能。早在2002年已經(jīng)報(bào)道了PD-L1能協(xié)助腫瘤進(jìn)行免疫逃逸，接下來(lái)的報(bào)道逐漸證明阻斷PD-1/PD-L1通路能增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答能力[5-7]。臨床的研究表明PD-L1的表達(dá)與疾病進(jìn)行以及預(yù)后效果息息相關(guān)。因此，運(yùn)用抗PD-1或抗PD-L1的單克隆抗體將PD-1/PD-L1信號(hào)通路阻斷成為一種新的免疫治療手段[8]。免疫檢查點(diǎn)抑制療法在臨床上如火如荼地進(jìn)行著，最熱門的PD-1/PD-L1抗體免疫治療占據(jù)免疫檢查點(diǎn)治療20%的比例。2016年5月18日，羅氏PD-L1藥物Atezolizumab獲得FDA批準(zhǔn)，用于膀胱癌適用癥，成為第一個(gè)上市的PD-L1藥物；2017年3月23日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)默克/輝瑞旗下的Avelumab上市，成為第二個(gè)上市的PD-L1藥物。目前還在臨床試驗(yàn)的還有BMS-936559、MEDI4736、MPDL3280A等抗體，PD-L1抗體藥物的發(fā)展前景十分廣闊。

本研究旨在通過(guò)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)篩選出能分泌高特異性、高親和力的抗人PD-L1單克隆抗體細(xì)胞株，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證抗體與腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)合能力，用腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗體的阻斷功能，為后續(xù)檢測(cè)抗體以及抗體藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 人PD-L1重組蛋白(novop-rotein,Catalog# C315)；抗人PD-L1標(biāo)準(zhǔn)抗體(R&D,Catalog# MAB1561)；Freund完全佐劑、Freund不完全佐劑、BCA protein assay kit購(gòu)自Pierce公司，PRMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT、HT均為Gibco公司產(chǎn)品;SBA Clonotyping System-HRP(Southern-Biotech,5300-05);質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自Magen公司；APC-PD-L1、Alexa Flour 647 Goat anti-mouse IgG購(gòu)自Biolegend;CytoTox 96? Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒(Promega,Catalog# G1780);酶標(biāo)二抗(KPL,Catalog #074-1806)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料 無(wú)特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級(jí)BALB/c純系雌性小鼠，鼠齡6～8周，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞、Caov3、H1299、OV2008、C13、A549、A549/DDP、MCF-7等腫瘤細(xì)胞株為暨南大學(xué)抗體工程中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存；正常人血清采集于健康志愿者。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PD-L1 mAb的制備 采用購(gòu)買的人PD-L1重組蛋白為免疫原，取6周齡的BALB/c雌鼠，皮下多點(diǎn)免疫方法，免疫劑量為50 μg/只。采用常規(guī)細(xì)胞融合及篩選方法[9],最終篩選出4株陽(yáng)性細(xì)胞株，采用小鼠體內(nèi)誘生法制備腹水型抗體；Protein G親和層析柱進(jìn)行純化后備用。

1.2.2PD-L1 mAb Ig類及亞類的鑒定 采用SBA Clonotyping System-HRP試劑盒對(duì)篩選的抗體Ig類及亞類進(jìn)行測(cè)定，所有操作嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.3PD-L1 mAb抗體親和常數(shù)的測(cè)定 非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定其親和常數(shù)(Affinity constant)，Ka值。參考Raghava等[10]的方法，按照公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)Ka值。

1.2.4PD-L1 mAb抗體特異性的鑒定 將人PD-L2蛋白稀釋為1 μg/ml，每孔100 μl加入酶標(biāo)板中，4℃孵育過(guò)夜。用含0.05%吐溫的PBST洗滌3次，每次3 min，再用5%的脫脂奶粉于37℃封閉1 h,PBST洗滌3次，每次3 min。將純化后抗體從1∶1 000開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋。每孔加入100 μl,37℃孵育1 h。PBST洗滌3 次，每次3 min,再加入8 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗100 μl，37℃孵育40 min。PBST 洗滌5次，加入TMB單組分顯色液，室溫避光反應(yīng)10 min后加入50 μl濃硫酸終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450值，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.5PD-L1抗體在Western blot檢測(cè)上的應(yīng)用 裂解腫瘤細(xì)胞，提取總蛋白[11]，經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜后加入稀釋的PD-L1純化抗體(1∶2 000)，4℃反應(yīng)過(guò)夜后取出膜PBST洗滌3次，加入HRP酶標(biāo)二抗(1∶8 000)室溫反應(yīng)1 h，洗滌5次，加入化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)，在凝膠成像儀成像。

1.2.6PD-L1抗體在流式檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1表型上的應(yīng)用 離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌，用制備的抗體(10 μg/ml)與腫瘤細(xì)胞室溫孵育15 min,預(yù)冷PBS洗滌1次后加入Alexa Flour 647 Goat anti-mouse IgG室溫避光反應(yīng)15 min，預(yù)冷PBS洗滌1次后用300 μl PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)[12]。

1.2.7PD-L1單抗阻斷功能驗(yàn)證 CIK(Cytokine-induced killer)是體外培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群[13]，其既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力，是目前臨床上廣泛使用的過(guò)繼性免疫治療細(xì)胞。然而，CIK在腫瘤殺傷過(guò)程中，受到PD-1/PD-L1信號(hào)的限制，在高表達(dá)PD-L1的腫瘤殺傷中效果不佳，因此，阻斷PD-1/PD-L1通路是增強(qiáng)CIK免疫治療的有力措施。

從外周血中分離PBMC細(xì)胞，第0天加入1 000 U/ml IFN-γ 37℃,5%CO2培養(yǎng)；24 h后加入50 ng/ml 的CD3單克隆抗體和300 U/ml的重組人IL-2，刺激CIK細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[14]；每3 d半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；在培養(yǎng)的第14天，收獲CIK細(xì)胞。用anti-TCR抗體刺激CIK細(xì)胞，每隔6 h收集細(xì)胞檢測(cè)其PD-1表達(dá)情況。另外，用CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞A549/DDP以40∶1、20∶1、10∶1、5∶1比例混合，并加入PD-L1抗體10 μg/ml，37℃ 5%CO2培養(yǎng)4～6 h，用CytoTox96? Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒檢測(cè)各組釋放LDH的量，通過(guò)公式：%Cytotoxicity=(LDHexperimental-LDHeffector cells-LDHspontaneous)/(LDHmaximal-LDHspontaneous)×100%，計(jì)算CIK細(xì)胞的腫瘤殺傷率[15]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖，并分析不同數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。運(yùn)用SPSS軟件對(duì)不同組數(shù)據(jù)之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1抗人PD-L1蛋白單克隆抗體的制備 用購(gòu)買的重組人PD-L1蛋白免疫BALB/c小鼠3次，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，通過(guò)3次陽(yáng)性克隆，獲得4株穩(wěn)定分泌抗人PD-L1單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為Ab1、Ab2、Ab3、Ab4。制備大量的腹水型抗體后，通過(guò)親和純化，用還原性SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，抗體重鏈和輕鏈條帶Mr分別在50 bp和25 bp 左右(圖1)，無(wú)明顯雜帶，抗體純化效果較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2抗人PD-L1抗體Ig 亞型、腹水效價(jià)及特異性鑒定 用SBA小鼠mAb分型試劑盒測(cè)定純化的4種單克隆抗體Ig類及其亞類。結(jié)果顯示Ab3為IgG2b，其余3株抗體均為IgG1。采用間接ELISA對(duì)4株抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示其腹水效價(jià)在1∶2.56×106～1∶4×104之間，親和力在1.5×109～1.0×107之間，且與結(jié)構(gòu)及功能相似的PD-L2蛋白無(wú)明顯交叉反應(yīng)，說(shuō)明特異性較好(表1)。

2.3PD-L1抗體在Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)量上的應(yīng)用 用Ab2抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞裂解液中PD-L1蛋白進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示Ab2抗體能在蛋白水平上與腫瘤細(xì)胞中PD-L1蛋白結(jié)合， 無(wú)明顯雜帶，說(shuō)明抗體特異性良好，能應(yīng)用于Western blot方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)量。

表1 抗體特異鑒定

Note：“-”Indicating that the OD450 value is less than twice the negative value,proved no cross-reaction with the PD-L2 protein.

圖2 PD-L1單抗應(yīng)用于免疫印跡分析不同腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of PD-L1 in different kinds of tumor cell lines were analyzed by Western blot used PD-L1 mAb

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析不同腫瘤細(xì)胞系中PD-L1蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of PD-L1 in different kinds of tumor cell lines were analyzed by FACS

圖4 PD-L1抗體在CIK細(xì)胞殺傷腫瘤中的作用Fig.4 Function of PD-L1 antibody in CIK cell killing tumorNote:A.Differential expression of two main phenotypic subsets of CIK cells over in vitro culture are shown for identification of CIK cells,CD3/CD56/CD8;B.PD-1 expression after CIK cell activation;C.PD-L1 blocking antibodies efficiently increases tumor-killing activity of CIK cells.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

2.4PD-L1抗體在流式檢測(cè)腫瘤細(xì)胞PD-L1表型上的應(yīng)用 用制備的Ab1作為一抗，Alexa Flour 647 Goat anti-mouse IgG作為熒光二抗，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞膜表面PD-L1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示制備的Ab1抗體能特異性標(biāo)記腫瘤細(xì)胞膜PD-L1蛋白，說(shuō)明Ab1能與PD-L1天然蛋白特異性結(jié)合，能很好的應(yīng)用于流式檢測(cè)抗體。

2.5抗體具有促進(jìn)CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 因CIK有CTL(殺傷性T細(xì)胞)的特性，因此具有CD3+CD8+表型；另一方面它還具有NK細(xì)胞的非MHC限制性殺傷特性，因此具有CD56+表型。培養(yǎng)14 d后的CIK細(xì)胞中CD3+CD8+細(xì)胞比例高達(dá)77.7%，CD3+CD56+細(xì)胞比例高達(dá)43.3%(見(jiàn)圖4A)，證明CIK細(xì)胞培養(yǎng)成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

用anti-TCR抗體激活CIK細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其PD-1分子表達(dá)量顯著增高(見(jiàn)圖4B)，證明PD-1分子在CIK細(xì)胞激活后表達(dá)升高，從而通過(guò)PD-1/PD-L1通路負(fù)調(diào)控CIK細(xì)胞的活性和功能。用培養(yǎng)14 d的成熟CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP進(jìn)行殺傷，并加入PD-L1抗體和Control IgG，檢測(cè)靶細(xì)胞的死亡率。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，加入Ab1和Ab2抗體組均能促進(jìn)CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷(見(jiàn)圖4C)，表明這兩株抗體可能具有阻斷PD-1/PD-L1通路活性，進(jìn)而在細(xì)胞免疫治療中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤殺傷的作用。

3 討論

近來(lái)越來(lái)越多的研究表明，PD-1以及PD-L1的表達(dá)與癌癥患者的臨床病征以及預(yù)后密切相關(guān)[16]，因此PD-L1抗體無(wú)論在檢測(cè)診斷中或者藥物治療中都有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)免疫PD-L1重組蛋白，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合、克隆化篩選、抗體大量制備、純化等技術(shù)獲得了4株特異性識(shí)別人PD-L1蛋白的單克隆細(xì)胞株，其中Ab1和Ab2具有較高的滴度和親和力，Ab1腹水型抗體效價(jià)更是高達(dá)1∶2.56×106，明顯優(yōu)于國(guó)內(nèi)報(bào)道制備的抗人PD-L1單抗[17]；在流式檢測(cè)中，Ab1抗體的工作濃度為3 μg/106cells，略低于國(guó)外生產(chǎn)的流式檢測(cè)抗體(2.5 μg/106cells)；后續(xù)實(shí)驗(yàn)將改進(jìn)檢測(cè)方法以提高檢測(cè)靈敏度。所獲得的Ab2抗體在Western blot 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)量中抗體工作濃度為 2 μg/ml，檢測(cè)條帶單一清晰，說(shuō)明其特異性強(qiáng)，可適用于Western blot檢測(cè)；制備的Ab1、Ab2抗體能促進(jìn)CIK細(xì)胞對(duì)A549/DDP細(xì)胞系的殺傷作用，證實(shí)該抗體具有一定的阻斷PD-1/PD-L1通路的作用，可作為阻斷抗體應(yīng)用于臨床研究。

隨著PD-1/PD-L1抗體治療的廣泛應(yīng)用，PD-L1在腫瘤及正常組織上的檢測(cè)成為評(píng)估該治療方法有效性的重要指標(biāo)。而國(guó)外的檢測(cè)抗體價(jià)格普遍偏高，因此制備成本較低的高效價(jià)、高特異性PD-L1抗體具有極大的意義，而本研究制備的抗體能滿足基本的檢測(cè)需要。但是由于制備的PD-L1抗體是鼠源抗體，在腫瘤治療中將有很大的限制，后續(xù)研究將進(jìn)行人源化改造以及親和力成熟，為進(jìn)一步PD-L1抗體藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2017-03-13 修回2017-04-09]

(編輯 倪 鵬)

Preparationandapplicationofanti-humanPD-L1monoclonalantibodies

FENGPei-Ran,HUANGJian-Fang,WANGMin-Zhen,LIAOWei-Cong,HAODai-Ling,XIANGJun-Jian.AntibodyEngineeringResearchCenter,JinanUniversity,GuangdongProvinceKeyLaboratoryofMolecularImmunologyandAntibodyEngineering,Guangzhou510632,China

Objective:To obtain a high specificity and high affinity anti-human PD-L1 monoclonal antibody which can be used for clinical diagnosis and block PD-L1 and PD-1 binding.Methods:BALB/c mice were immunized with recombinant PD-L1 protein.The positive cell clones stably secreting anti-human PD-L1 monoclonal antibody were obtained by classical hybridoma cell fusion technique.The specificity,affinity,subtype and other characteristics of the antibody were identified by ELISA.Immunofluorescence and indirect immunofluorescence were used to detect the tumor cells.Antibody blocking activity was confirmed by tumor killing test.Results:Two cell strains stably secreting monoclonal antibodies against human PD-L1 were screened out.Ab1 and Ab2 had high titer and affinity.The antibody titers were 1∶2.56×106and 1∶3×105,and the affinity was 1.5×109L/mol and 2.5×108L/mol respectively.There was no cross reaction between these two antibodies and PD-L2.Immunoblotting,indirect immunofluorescence confirmed that the antibody can be used to the diagnosis.Experiment showed that PD-L1 antibodies can increases tumor-killing activity of CIK cells.Conclusion:Two hybridoma cell lines capable of stably secreting highly specific and high affinity anti-human PD-L1 monoclonal antibody are obtained.They can specifically bind to PD-L1 molecules on tumor cells and can be used to the diagnosis of tumor phenotype and prognosis.Antibody blocking function can be applied to combined CIK cell immunotherapy.

PD-L1；Monoclonal antibody；Flow cytometry；Cytokine-induced killer cells；Tumor diagnosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.015

①本文為廣東省人才引進(jìn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目《重大疾病的臨床診斷試劑研發(fā)》(2013S028)。

②暨南大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究院國(guó)際免疫學(xué)中心，廣州510632。

馮沛然(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事抗體制備及應(yīng)用方面研究。

及指導(dǎo)教師：向軍儉(1952年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事工程抗體及其應(yīng)用研究，E-mail:txjj@jnu.edu.cn。

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1000-484X(2017)06-0879-05