黃玉鈿，陳義忠，周瑞祥，鄭 曦，薛玉欽，吳 進福建醫(yī)科大學附屬福州市第一醫(yī)院病理科，福建 福州 50009；福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系；人體解剖與組織胚胎學系，福建 福州 50000

褪黑素與乳腺癌雌激素受體表達的相關(guān)性分析

黃玉鈿1，陳義忠2，周瑞祥3，鄭 曦1，薛玉欽1，吳 進11福建醫(yī)科大學附屬福州市第一醫(yī)院病理科，福建 福州 350009；福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院2免疫學系；3人體解剖與組織胚胎學系，福建 福州 350000

目的研究褪黑素對大鼠乳腺癌組織中雌激素受體表達的影響，分析褪黑素在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法選用2月齡清潔級雌性SD大鼠90只，接種大鼠乳腺癌細胞，隨機分為注射生理鹽水對照組、7.5 mg/（kg·d）注射褪黑素組、15 mg/（kg·d）注射褪黑素組，10 d后乳腺癌大鼠荷瘤模型建立成功并取乳腺癌組織，采用免疫組化法檢測乳腺癌中雌激素受體的表達情況。結(jié)果注射褪黑素組的大鼠乳腺癌組織雌激素受體表達指數(shù)低于注射生理鹽水對照組，隨著注射褪黑素劑量上升，雌激素受體表達指數(shù)進一步下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論褪黑素能抑制乳腺癌組織中雌激素受體的表達，可能是褪黑素拮抗乳腺癌發(fā)生發(fā)展的途徑之一。

褪黑素；乳腺癌；雌激素受體

乳腺癌的發(fā)生與機體雌激素水平關(guān)系密切[1]，雌激素分泌上升通過與乳腺上皮細胞的雌激素受體（ER）結(jié)合，使細胞過度增殖甚至癌變，是乳腺癌發(fā)生的一個重要風險因素[2]。有相關(guān)研究表明，長期夜班工作的女性雌激素水平及患乳腺癌風險增高，而體內(nèi)褪黑素分泌量相對較低[3-4]。褪黑素是否能通過抑制雌激素作用途徑而拮抗乳腺癌的發(fā)生發(fā)展尚未完全明確，本研究通過建立大鼠乳腺癌模型，研究褪黑素與乳腺癌組織中ER表達指數(shù)的關(guān)系，探討褪黑素在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組和試劑

選用2月齡清潔級雌性SD大鼠90只，體質(zhì)量200±10 g，標準飼養(yǎng)。隨機分成3組，每組30只，分組如下：（1）注射生理鹽水對照組；（2）7.5 mg/（kg·d）注射褪黑素組；（3）15 mg/（kg·d）注射褪黑素組。大鼠乳腺癌細胞SHZ-88購自上海生命科學院，褪黑素購自美國Sigma，兔抗大鼠ER多克隆抗體購自英國Biorbyt，免疫組化試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.2 建立荷瘤大鼠模型

乳腺癌細胞株于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，細胞處于對數(shù)生長期時，制作單細胞懸液，每只大鼠按5×105細胞量在大腿內(nèi)側(cè)根部皮下接種乳腺癌單細胞懸液1次；自接種日起，每天18：00按照不同分組的干預措施，給予腹腔內(nèi)注射褪黑素或生理鹽水1次，接種后第10天可觸及接種處皮下瘤塊并處死所有荷乳腺癌大鼠，切除接種處乳腺癌瘤體。

1.3 免疫組化法檢測

大鼠乳腺癌以4%中性緩沖甲醛固定，再經(jīng)酒精脫水、透明浸蠟后，制作石蠟包埋組織塊。乳腺癌石蠟包埋組織切片（厚度3～5 μm）以免疫組化兩步法檢測ER在乳腺癌中的表達，步驟如下：組織切片經(jīng)脫蠟、水化后，以枸櫞酸高壓熱修復抗原，冷卻后加PBS液沖洗，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液沖洗，滴加ER抗體（工作液濃度1∶150），孵育1 h，PBS液沖洗，加聚合物增強劑孵育30 min，PBS液沖洗，加酶標羊抗兔/鼠IgG聚合物孵育30 min，PBS液沖洗，DAB顯色，蘇木精襯染，梯度酒精脫水干燥，中性樹脂封片。以PBS液代替ER作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。受檢組織切片于高倍鏡下觀察熱點區(qū)內(nèi)5個視野，計算每個視野中（ER陽性癌細胞數(shù)/癌細胞總數(shù)×100%）的比值，以平均比值（%）代表大鼠乳腺癌細胞ER表達指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理

以均數(shù)±標準差表示各組乳腺癌ER表達指數(shù)，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，不同分組間定量資料的比較采用t檢驗，P＜0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織雌激素受體表達差異

ER表達于乳腺癌細胞核上（圖1），陽性細胞核呈棕色，注射生理鹽水對照組大鼠乳腺癌組織ER表達指數(shù)為（28.61±12.52）%，高于注射褪黑素組大鼠乳腺癌組織ER表達指數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

圖1 大鼠乳腺癌細胞核ER陽性表達（免疫組化檢測，×400）

表1 不同分組大鼠乳腺癌組織雌激素受體表達情況（，n=30）

表1 不同分組大鼠乳腺癌組織雌激素受體表達情況（，n=30）

*P＜0.05 vs 注射生理鹽水組；**P＜0.05 vs 7.5 mg/（kg·d）注射褪黑素組.

組別ER表達指數(shù)（%）tP注射生理鹽水組 28.61±12.52 7.5 mg/（kg·d）注射褪黑素組22.49±9.262.1526＜0.05*15 mg/（kg·d）注射褪黑素組18.02±7.172.0905＜0.05**

2.2 注射不同劑量褪黑素對大鼠乳腺癌組織雌激素受體表達的影響

7.5 mg/（kg·d）注射褪黑素組大鼠乳腺癌組織ER表達指數(shù)高于15 mg/（kg·d）注射褪黑素組（22.49±9.26）% vs （18.02±7.17）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

3 討論

褪黑素是由松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，屬于吲哚類激素，是L-色氨酸前體物質(zhì)，化學名為N-乙酰-5-甲氧基色胺[5]。該激素于1958年由Aron等[6]首次從牛松果體中發(fā)現(xiàn)，當青蛙攝入此激素后會使深色蛙皮褪色，故被稱為褪黑素。褪黑素具有多種生理作用，涉及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)、生物節(jié)律、激素分泌調(diào)節(jié)、抗氧自由基損傷等方面，其異常分泌與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[7-8]。在多種腫瘤中的研究表明[9-10]，褪黑素具有抑制惡性腫瘤進展的作用，其機制尚未完全明確。根據(jù)流行病學調(diào)查，長期從事夜班工作的婦女乳腺癌發(fā)生率比盲人婦女明顯增高，由于對夜間光線的回避能使褪黑素分泌量上升，從而提示褪黑素分泌量高可能是盲人婦女乳腺癌發(fā)病率低的因素[11]。González等[12]研究表明，機體內(nèi)褪黑素分泌量與雌激素分泌量呈負相關(guān)，但異常的褪黑素及雌激素分泌在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的影響機制尚未明確。

雌激素通過與位于乳腺上皮細胞的雌激素受體結(jié)合，改變雌激素受體構(gòu)象，調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A等信號轉(zhuǎn)導途徑[13]，刺激多種促進細胞生長的基因高表達，提高乳腺上皮細胞增殖活性，抑制細胞凋亡，導致乳腺癌的發(fā)生[14]。Chuffa等[15]研究表明褪黑素對機體內(nèi)雌激素分泌的調(diào)節(jié)主要通過神經(jīng)內(nèi)分泌-生殖軸影響卵巢功能，下調(diào)卵巢的雌激素分泌量；而褪黑素對腫瘤組織中ER表達的調(diào)控則有待進一步研究。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射褪黑素的大鼠乳腺癌組織中ER表達指數(shù)低于腹腔注射生理鹽水的大鼠乳腺癌組織（P＜0.05），提示褪黑素會抑制乳腺癌組織中雌激素受體的表達。褪黑素高劑量組大鼠乳腺癌組織中ER表達指數(shù)低于褪黑素低劑量組（P＜0.05），表明褪黑素在抑制雌激素受體表達上具有一定的劑量依賴性，進一步提示褪黑素能通過下調(diào)雌激素受體表達拮抗乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明，褪黑素抵抗雌激素受體表達的主要機制是褪黑素通過細胞膜結(jié)合蛋白Gi與褪黑素受體偶聯(lián)[16]，抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，使環(huán)磷酸腺苷水平下降，進而抑制由雌二醇誘導的ER轉(zhuǎn)錄活性[17]，下調(diào)ER的表達。

目前國內(nèi)外關(guān)于褪黑素與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究主要集中于褪黑素對機體雌激素分泌的影響，褪黑素能通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸[18]和卵巢粒層細胞功能[19]下調(diào)卵巢的雌激素產(chǎn)生水平，從而拮抗乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。有關(guān)褪黑素對乳腺癌雌激素受體的影響主要是通過乳腺癌MCF-7細胞體外實驗研究，表明褪黑素能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導而抑制MCF-7細胞ER轉(zhuǎn)錄活性[20-21]。本研究則通過建立荷乳腺癌大鼠動物模型，從癌細胞接種日起以褪黑素干預實驗組乳腺癌的生長，通過體內(nèi)實驗研究在大鼠乳腺癌細胞增殖過程中褪黑素對雌激素受體表達的影響，研究結(jié)果更直接體現(xiàn)乳腺癌生長過程中褪黑素對雌激素受體的影響。本研究結(jié)果顯示機體內(nèi)褪黑素水平與乳腺癌組織中ER的表達指數(shù)呈負相關(guān)，提示褪黑素除了直接降低雌激素分泌效應之外，還能通過下調(diào)乳腺癌組織中雌激素受體的表達，阻礙雌激素作用的通路，從而抑制乳腺癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，因此褪黑素有望在乳腺癌的治療中發(fā)揮重要作用。

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Correlation of melatonin and estrogen receptor expression in breast cancer

HUANG Yudian1, CHEN Yizhong2, ZHOU Ruixiang3, ZHENG Xi1, XUE Yuqin1, WU Jin11Department of Pathology, Fuzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350009, China;2Department of Immunology;3Department of Anatomy and Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350000, China

ObjectiveTo study the effect of melatonin on the expression of estrogen receptor in rats breast cancer, and to analyze the role of melatonin in the development of breast cancer.MethodsNinety female rats of clean grade SD in age 2 months were selected, and the breast cancer cells were inoculated in the rats. The rats were randomly divided to control group injected with saline, group injected with melatonin at a dose of 7.5 mg/(kg·d), group injected with melatonin at a dose of 15 mg/(kg·d). The breast cancer tumor bearing models of rats were established on the 10th day after inoculating, and the tissues of breast cancer were taken out. The expression of estrogen receptor in breast cancer was detected by immunohistochemistry method.ResultsThe estrogen receptor expression index of rats breast cancer tissues in the group injected with melatonin was lower than that in the control group injected with saline, the estrogen receptor expression index further decreased with the increase of the dose of melatonin. Above differences were statistically significant.ConclusionMelatonin can inhibit the expression of estrogen receptor in breast cancer tissues, which may be one of the ways to prevent the development of breast cancer.

melatonin; breast cancer; estrogen receptor

2016-11-30

福建省自然科學基金（2015J01503）

黃玉鈿，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail： hydfz0591@163.com；