高建德，朱曉玉，劉雄，陳暉，宋開蓉，師婷婷

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響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取枸杞子總黃酮的工藝研究

高建德，朱曉玉，劉雄，陳暉，宋開蓉，師婷婷

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000

目的 采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取枸杞子總黃酮的工藝條件。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度為因素，進(jìn)行3因素3水平的中心組合設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法分析3個(gè)因素對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響。結(jié)果 復(fù)合酶輔助提取枸杞子總黃酮的工藝路線為：復(fù)合酶用量0.30%，酶解時(shí)間1.0 h，酶解溫度60 ℃?？傸S酮得率預(yù)測值為0.949 2%。結(jié)論 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶輔助提取枸杞子總黃酮的方法穩(wěn)定可行，操作簡單，可為深入研究及應(yīng)用提供依據(jù)。

響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化；復(fù)合酶提取；枸杞子總黃酮

枸杞子是茄科植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實(shí)[1]，性平，味甘、微苦，無毒，具有滋養(yǎng)肝腎、潤肺益氣、生精助陽、明目等功效。黃酮類化合物是枸杞子的有效組分之一，具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、清除自由基[5]、抗炎[6]等作用。目前，黃酮類化合物的提取方法主要有回流提取法[7-8]、超聲提取法[9-10]、微波輔助提取法[11]及CO2超臨界流體萃取法[12]。生物酶技術(shù)具有提取效率高、提取時(shí)間短、綠色環(huán)保及提取條件溫和等優(yōu)勢[13]，近年來在中藥黃酮類、多糖類、生物堿類等有效組分提取中均有廣泛應(yīng)用。生物酶輔助提取枸杞子的有效組分雖有報(bào)道，但以研究提取枸杞子多糖[14-15]為主，而在提取枸杞子黃酮類成分方面報(bào)道甚少。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取枸杞子總黃酮的工藝，為枸杞子的綜合利用及提高黃酮類化合物的提取率提供一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UV Blue Star B型紫外-可見分光光度計(jì)（北京萊佰泰科技有限公司），DD-5M離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），AL104型電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），HH-4電熱恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），AKRYUP-1816超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司），PHS-3E pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

枸杞子（批號(hào)20150923），購于蘭州黃河藥市，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實(shí)；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)10080-200707），中國食品藥品檢定研究院；果膠酶（批號(hào)CNC1048446715）、纖維素酶（批號(hào)CNC1048447624），寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

稱取枸杞子10.0 g，粉碎，過1號(hào)篩，加8倍量石油醚脫脂（2次，1.5 h/次），藥渣風(fēng)干。風(fēng)干后的藥渣裝入燒杯，按照不同的酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間，加入一定量磷酸緩沖液（pH＝4.2）進(jìn)行酶解提取，過濾，酶解提取后的藥渣加10倍量水提取2次，1 h/次，提取液濃縮至浸膏（每1 mL濃縮液相當(dāng)于0.5 g原藥材），冷卻，加無水乙醇至含醇量達(dá)65%，靜置過夜，3500 r/min離心10 min，移取上清液5 mL置于50 mL容量瓶中，65%乙醇定容，作為待測溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與總黃酮得率計(jì)算

準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.010 g，置于50 mL容量瓶中，加入65%乙醇溶液定容，即得蘆丁對(duì)照品溶液。分別精確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶中，各加入65%乙醇2.0 mL，再各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，最后用65%乙醇定容，搖勻，室溫放置15 min，以加入純水、其他試劑相同的溶液為參比液，在波長510 nm處測其吸光度。以蘆丁對(duì)照品溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程＝0.523－0.010 9（2＝0.999 4）。根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，求得總黃酮得率（浸出總黃酮質(zhì)量÷枸杞子質(zhì)量×100%）。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 液料比對(duì)提取效果的影響 以總黃酮得率為指標(biāo)，脫脂后的藥渣，復(fù)合酶（果膠酶∶纖維素酶＝1∶1，pH＝5.31）用量0.20%，加入pH 4.2磷酸緩沖液，50 ℃酶解1.5 h，酶解后的藥渣加10倍量水回流提取2次，每次1 h，考察不同液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1）對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖1?？梢?，液料比在6∶1～10∶1范圍內(nèi)時(shí)，枸杞子總黃酮得率隨著液料比的增加而提高，呈上升趨勢；液料比大于10∶1時(shí)，枸杞子總黃酮得率雖有所下降，但下降趨勢不明顯，基本趨于平行。故選用10∶1作為最佳液料比。

圖1 液料比對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響

2.3.2 酶用量對(duì)提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標(biāo)，50 ℃酶解1.5 h，加入pH 4.2緩沖液，考察復(fù)合酶用量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）對(duì)提取效果的影響，酶解后的藥渣按液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h。結(jié)果見圖2?？梢姡瑥?fù)合酶用量在0.10%～0.25%時(shí)，隨著酶濃度的增加，枸杞子黃酮得率亦增大，呈上升趨勢；酶用量在0.25%～0.30%時(shí)，枸杞子黃酮得率呈下降趨勢，但下降幅度不大。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中選取0.15%～0.25%范圍進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 酶用量對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響

2.3.3 酶解溫度對(duì)提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標(biāo)，復(fù)合酶用量為0.20%，酶解時(shí)間為1.5 h，加入pH 4.2緩沖液，考察酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對(duì)提取效果的影響，酶解后的藥渣，按照液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h。結(jié)果見圖3?？梢?，在溫度40～50 ℃時(shí)，枸杞子黃酮得率隨酶解溫度的升高而呈上升趨勢；在溫度55 ℃時(shí)，枸杞子總黃酮得率略有下降，可能是誤差所致。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中，選取40、50、60 ℃作為酶解溫度的3個(gè)水平。

2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標(biāo)，復(fù)合酶用量為0.20%，酶解溫度50 ℃，加入pH 4.2緩沖液，考察酶解時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）對(duì)提取效果的影響，酶解后的藥渣，按照液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h，結(jié)果見圖4?？梢?，酶解時(shí)間為0.5～1.5 h時(shí)，枸杞子總黃酮得率隨時(shí)間延長呈上升趨勢；酶解時(shí)間為1.5～2.5 h，枸杞子總黃酮得率雖有小幅增長，但增幅并不明顯。故在響應(yīng)面試驗(yàn)中選取1、1.5、2 h作為酶解時(shí)間的3個(gè)水平。

圖3 酶解溫度對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響

2.3.5 pH值對(duì)提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標(biāo)，復(fù)合酶用量為0.20%，在50 ℃酶解1.5 h，考察pH值（4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）對(duì)提取效果的影響，酶解后的藥渣，按液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h，結(jié)果見圖5?？梢?，pH值4.0～4.2時(shí)，總黃酮得率隨著pH值增大而呈上升趨勢；pH值4.4～5.2時(shí)，枸杞子總黃酮得率不再上升，反而呈下降趨勢。故選用pH值4.2為宜。

圖5 pH值對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（見表1），根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，以復(fù)合酶用量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）為自變量，枸杞子總黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)分析，結(jié)果見表2。所得數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件得到回歸方程：＝0.74＋0.038＋0.051＋0.072－0.016－3.025×10-3－0.064＋0.0592＋0.0652－0.0532。采用SAS RSREG回歸分析對(duì)方程和方程的各個(gè)因子進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性用檢驗(yàn)來判定，值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，＜0.01時(shí)影響為極顯著，＜0.05時(shí)影響為顯著。通過比較方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小，可以判斷各因素對(duì)枸杞子總黃酮得率影響的主次順序?yàn)镃（酶解溫度）＞B（酶解時(shí)間）＞A（酶用量）。

表1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)因素水平表

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面法統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

由表3可知，此模型＜0.000 1，表明響應(yīng)面回歸達(dá)到極顯著水平，說明模型回歸顯著可靠，A（酶用量）、B（酶解時(shí)間）和C（酶解溫度）對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響極顯著（＜0.01），同時(shí)，B（酶解時(shí)間）和C（酶解溫度）的交互作用對(duì)枸杞子總黃酮得率影響極顯著，A（酶用量）、B（酶解時(shí)間）和C（酶解溫度）的平方項(xiàng)對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響極顯著，說明A（酶用量）、B（酶解時(shí)間）和C（酶解溫度）對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響不是簡單的線性關(guān)系，平方項(xiàng)和交互項(xiàng)也具有很重要的作用，這與模型分析的結(jié)果相同。此響應(yīng)面模型2為95.93%，說明模型響應(yīng)值（總黃酮得率）的變化95.93%來自所選的因變量?；貧w方程可以較好地描述與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，利用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算是合理可靠的。

2.5 響應(yīng)面圖分析結(jié)果

通過多元回歸方程所作的響應(yīng)面及等高線圖見圖6～圖8，所擬合的響應(yīng)曲面和等高線圖能比較直觀地反映各因素間的交互作用。

由圖6可知，當(dāng)酶用量較低時(shí)，隨酶解時(shí)間的增加，枸杞子總黃酮得率增長較快，當(dāng)酶用量增大時(shí)，酶解時(shí)間越長，枸杞子黃酮得率反而會(huì)有所下降。枸杞子總黃酮得率極大值在酶用量0.15%～0.25%、酶解時(shí)間1～1.6 h。

由圖7可知，酶用量不變，隨著酶解溫度升高，枸杞子總黃酮得率呈上升趨勢，當(dāng)酶解溫度在40～45 ℃范圍時(shí)，枸杞子總黃酮得率較高。當(dāng)酶解溫度恒定時(shí)，酶用量在0.15%～0.25%范圍內(nèi)，枸杞子總黃酮得率隨著酶濃度增大而上升。

由圖8可知，酶解時(shí)間不變，酶解溫度對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響呈先增后減的趨勢。酶解溫度恒定時(shí)，酶解時(shí)間對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響呈現(xiàn)上升的趨勢。枸杞子總黃酮得率的極大值在酶解時(shí)間1.0～2.0 h、酶解溫度45～60 ℃。

通過以上響應(yīng)面圖可以直觀分析各因素之間的交互作用對(duì)效應(yīng)值枸杞子總黃酮得率的影響，并根據(jù)回歸方程優(yōu)選出枸杞子總黃酮酶解提取的最佳工藝條件為：酶用量0.30%，酶解時(shí)間1.0 h，酶解溫度60 ℃。枸杞子總黃酮得率預(yù)測值為0.949 2%。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取枸杞子10.0 g，共5組，粉碎，按優(yōu)化的工藝條件提取枸杞子總黃酮，測得總黃酮得率平均值為0.930 3%，RSD＝0.94%。

2.7 酶解提取與傳統(tǒng)水提法比較

分別稱取枸杞子10.0 g，共6份。3份按最優(yōu)的工藝條件提取枸杞子總黃酮；另外3份不加酶，以相同溫度浸泡相同時(shí)間，加10倍量水，回流提取2次，1 h/次，比較2種方法的枸杞子總黃酮得率。結(jié)果見表4?？梢姡附馓崛》ㄋ描坭阶涌傸S酮得率明顯高于傳統(tǒng)水提法，說明生物酶在60 ℃溫度下仍然可以破壞枸杞子藥材結(jié)構(gòu)，使其總黃酮得到更有效的釋放。酶解提取枸杞子總黃酮方法操作簡單，工藝穩(wěn)定、可行。

表4 酶解提取與傳統(tǒng)水提法枸杞子總黃酮得率比較（%）

3 討論

響應(yīng)面法是近年來國內(nèi)外常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，相對(duì)于正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)等試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，響應(yīng)面法可以精確地找到最佳點(diǎn)，靈敏地考察各因素的交互作用，適用于中藥材提取工藝的優(yōu)選[16-17]?；貧w分析結(jié)果表明，酶用量、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)枸杞子總黃酮得率具有顯著影響；提取過程中，酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響極顯著，表明這3個(gè)因素對(duì)枸杞子總黃酮得率的影響不是簡單的線性關(guān)系。因此，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)，酶解溫度選擇40、50、60 ℃這3個(gè)水平，考慮溫度跨度大，運(yùn)用響應(yīng)面法可更好地選擇枸杞子總黃酮酶解的最佳溫度。

本試驗(yàn)優(yōu)化所得的酶解溫度為60 ℃，廠家提供纖維素酶的使用溫度為30～60 ℃，果膠酶在60 ℃時(shí)可縮短澄清果汁的時(shí)間，說明這2種酶在60 ℃時(shí)仍具有活性。魏金瑩[18]采用纖維素酶提取貝母中的貝母堿，其最優(yōu)提取條件為酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間為3.5 h，說明纖維素酶在60 ℃條件下活性可達(dá)2 h以上。

枸杞子總黃酮得率響應(yīng)方程的回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)表明，此方法合理可行。復(fù)合酶提取枸杞子總黃酮的最佳條件為：酶用量0.30%，酶解時(shí)間1.0 h，酶解溫度60 ℃。枸杞子總黃酮得率的預(yù)測值為0.949 2%，驗(yàn)證值為0.930 3%，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為0.018 9%。

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Optimization of Compound Enzyme Extraction Technology of Total Flavonoids from Lycii Fructus by Response Surface Method

GAO Jian-de, ZHU Xiao-yu, LIU Xiong, CHEN Hui, SONG Kai-rong, SHI Ting-ting

Objective To optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus by response surface methodology (RSM). Methods On the basis of single-factor tests, enzyme concentration, enzymolysis time, and enzyme solution temperature were selected as influencing factors during extraction to conduct three-factor three-level center combination design. The effects of three factors on the yield of total flavonoids from Lycii Fructus were analyzed by RSM. Results The optimum conditions for extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus were enzyme concentration 0.30%, enzymolysis time 1.0 h, enzyme solution temperature 60 ℃. The predicted extraction yield of total flavonoids was 0.949 2%. Conclusion Using RSM to optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus is stable, feasible, and simple, which can provide references for further study and application.

response surface method; technology optimization; compound enzyme extraction; total flavonoids from Lycii Fructus

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.016

R284.2

A

1005-5304(2017)07-0066-06

甘肅省科技攻關(guān)項(xiàng)目（GYC13-05）；甘肅省高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（2015B-073）

劉雄，E-mail：lx@gszy.edu.cn

（2016-08-31）

（2016-09-27；編輯：陳靜）