田會玲，李小黎，唐啟盛，李俠，李慶盟，高譽(yù)珊，張雯，孫新月，邵珺

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頤腦解郁復(fù)方對卒中后抑郁大鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū)病理損傷的影響

田會玲1，李小黎1，唐啟盛1，李俠1，李慶盟1，高譽(yù)珊2，張雯1，孫新月1，邵珺1

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

目的 探討頤腦解郁復(fù)方對腦卒中后抑郁（PSD）大鼠行為學(xué)和海馬CA1區(qū)病理損傷的干預(yù)作用。方法 將168只SPF級SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、卒中組、PSD組、西藥組和中藥組，正常組、假手術(shù)組各24只，其余組各30只。正常組不干預(yù)，假手術(shù)組不插入線栓，卒中組僅行大腦中動脈阻塞手術(shù)，PSD組、西藥組、中藥組卒中術(shù)后1周應(yīng)用慢性束縛應(yīng)激1周復(fù)合單籠飼養(yǎng)法制備PSD模型。造模開始時，西藥組灌胃鹽酸氟西汀，中藥組灌胃頤腦解郁復(fù)方，其余各組灌胃蒸餾水，每日1次。第2、4、8周末，各組大鼠進(jìn)行曠場試驗等行為學(xué)測試，HE染色觀察海馬CA1區(qū)病理變化。結(jié)果 除第2周外，同一時間點(diǎn)中藥組大鼠各項行為學(xué)評分均高于PSD組。同一時間點(diǎn)中藥組大鼠海馬CA1區(qū)較PSD組結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常。結(jié)論 頤腦解郁復(fù)方可改善大鼠PSD癥狀，并對海馬CA1區(qū)具有保護(hù)作用。

頤腦解郁復(fù)方；卒中后抑郁；行為學(xué)；海馬CA1區(qū)；大鼠

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是臨床腦卒中后常見并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲滯、興趣減退及社會角色的紊亂等。我國每年大約有160萬～200萬新發(fā)腦卒中患者，約1/3存活患者發(fā)生PSD[1-2]。頤腦解郁復(fù)方是本課題組自行研制治療PSD的中藥復(fù)方，具有益腎疏肝、活血化瘀的功效，前期臨床研究顯示療效顯著[3]。本實驗建立一種高度模擬臨床PSD的大鼠模型，以探討頤腦解郁復(fù)方對PSD大鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū)的干預(yù)作用。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠168只，2月齡，體質(zhì)量（300±20）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于室溫（20±2）℃、相對濕度50%～60%環(huán)境，光照明暗交替12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

頤腦解郁復(fù)方，北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供，依據(jù)前期研究[4]確定灌胃劑量為9.92 g/（kg?d），按照灌胃劑量煎藥濃縮，濃度為0.62 g原藥材/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前加熱；鹽酸氟西汀膠囊，禮來（蘇州）制藥公司，批號0943A，臨用時溶于蒸餾水，濃度為0.233 g/L，按照成人用量7倍計算大鼠用量為2.33 mg/（kg?d）。

1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，貨號P3761-5），磷酸鹽緩沖液（粉劑，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號PBS-0060），尼龍栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司，貨號2838-A4），蘇木素染色液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，編號201506251323），水溶性伊紅染色液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，編號YZB/京0102-2011），返藍(lán)染色液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，編號2015032514324659）。曠場試驗用敞箱（自制），強(qiáng)迫游泳試驗用水箱（自制），自動化智能型正置研究級顯微鏡（奧林巴斯有限公司，型號BX53）。

2 實驗方法

2.1 分組

大鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組24只、假手術(shù)組24只、卒中組30只、PSD組30只、西藥組30只、中藥組30只。正常組不干預(yù)，假手術(shù)組不插入線栓，卒中組僅進(jìn)行卒中手術(shù)，PSD組、西藥組和中藥組均在卒中手術(shù)后1周進(jìn)行PSD模型制備。自造模開始至實驗結(jié)束，西藥組和中藥組大鼠分別灌胃氟西汀、頤腦解郁復(fù)方藥液，其余各組每日灌胃等量蒸餾水。根據(jù)大鼠體質(zhì)量計算氟西汀、頤腦解郁復(fù)方藥液每日灌胃量，自腦卒中造模開始至實驗結(jié)束，每次約3～4 mL，每日1次。

2.2 造模

參考新式線栓法[5]，制備大腦中動脈阻塞的腦卒中模型，缺血2 h后進(jìn)行再灌注。入組標(biāo)準(zhǔn)：大鼠于缺血2 h后出現(xiàn)對側(cè)前肢蜷曲、行走轉(zhuǎn)圈或行走向?qū)?cè)倒體征則納入，無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。待腦卒中大鼠造模成功1周后，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)后，將群養(yǎng)的PSD組、西藥組、中藥組大鼠分開單籠飼養(yǎng)至實驗結(jié)束。孤養(yǎng)同時，每日10:00～16:00期間任取時間，將大鼠限制在特制的T型束縛臺[6]（自制）上予2 h的行為限制，連續(xù)7 d。

2.3 觀測方法

2.3.1 曠場試驗 第2、4、8周末對各組大鼠進(jìn)行曠場試驗。將大鼠置于敞箱中心方格內(nèi)，觀察大鼠3 min內(nèi)水平穿越格數(shù)（記為水平運(yùn)動得分）、后肢直立次數(shù)（記為垂直運(yùn)動得分）。

2.3.2 強(qiáng)迫游泳試驗 第2、4、8周末對各組大鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗。大鼠禁食21 h，水箱內(nèi)水深25 cm、水溫（25±1）℃，連續(xù)觀察5 min，記錄大鼠在水中強(qiáng)迫游泳時間。

2.3.3 糖水偏愛試驗 第2、4、8周末對各組大鼠進(jìn)行糖水偏愛試驗。大鼠禁食禁水20 h后，同時給予每只大鼠事先定量好的1瓶1%糖水和1瓶純水。30 min后調(diào)換糖水和純水的位置，60 min后取走2瓶并稱量，計算大鼠糖水消耗比例。糖水偏愛度＝糖水消耗量÷總液體消耗量。

2.3.4 病理觀察 第2、4、8周末大鼠行為學(xué)測試后，各時點(diǎn)大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g）麻醉，開胸暴露心臟，0.9%氯化鈉溶液快速灌注，再用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液內(nèi)室溫固定36 h，石蠟包埋后做冠狀切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)變化。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以±表示，組間比較采用方差分析，方差不齊用Welch法分析，兩兩比較用法。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 曠場試驗結(jié)果

在2、4、8周時，同一時點(diǎn)PSD組大鼠與卒中組比較水平運(yùn)動得分均降低，4周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），垂直運(yùn)動得分較卒中組均降低，4、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；西藥組大鼠與PSD組比較，同一時點(diǎn)水平運(yùn)動得分均增加，2、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），垂直運(yùn)動得分均增加，8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；同一時點(diǎn)中藥組大鼠水平運(yùn)動得分與PSD組比較均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；同一時點(diǎn)中藥組大鼠垂直運(yùn)動得分較PSD組均增加，4、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；中藥組與西藥組比較，2、4、8周時大鼠水平、垂直運(yùn)動得分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 強(qiáng)迫游泳試驗結(jié)果

在2、4、8周時，同一時點(diǎn)PSD組大鼠與卒中組比較強(qiáng)迫游泳時間均減少，2、4周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與PSD組比較，同一時點(diǎn)西藥組大鼠強(qiáng)迫游泳時間均增加，4、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；中藥組大鼠與PSD組比較，同一時點(diǎn)強(qiáng)迫游泳時間均增加，4、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；中藥組大鼠與西藥組比較，2、4、8周時強(qiáng)迫游泳時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表2。

4.3 糖水偏愛試驗結(jié)果

PSD組大鼠與卒中組比較，同一時點(diǎn)糖水偏愛度均降低，4、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；西藥組大鼠與PSD組比較，同一時點(diǎn)糖水偏愛度均升高，4、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；中藥組大鼠與PSD組比較，同一時點(diǎn)糖水偏愛度均升高，4、8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；中藥組大鼠與西藥組比較，糖水偏愛度2、4、8周時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表3。

表1 各組大鼠不同時點(diǎn)曠場試驗得分比較（±s，分）

注：與正常組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01；與假手術(shù)組比較，△＜0.05，△△＜0.01；與卒中組比較，#＜0.05，##＜0.01；與PSD組比較， □＜0.05，□□＜0.01（下同）

表2 各組大鼠不同時點(diǎn)強(qiáng)迫游泳時間比較（±s，s）

表3 各組大鼠不同時點(diǎn)糖水偏愛度比較（±s）

4.4 大鼠海馬CA1區(qū)病理觀察結(jié)果

2周時，正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有3～4層細(xì)胞，排列緊密，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核、核仁清晰；卒中組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)尚完整，細(xì)胞較假手術(shù)組排列疏松，有2～3層細(xì)胞，細(xì)胞染色加深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區(qū)有2～3層細(xì)胞，較卒中組更加疏松，細(xì)胞染色深、核固縮，核仁不明顯，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有3～4層正常細(xì)胞，排列緊密，核仁清晰，有少量細(xì)胞出現(xiàn)深染現(xiàn)象（見圖1）。4周時，正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)與2周時比較改變不明顯；卒中組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)尚完整，有1～2層細(xì)胞，較正常組排列疏松，細(xì)胞染色加深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)不完整，有1～2層細(xì)胞，較卒中組受損加重，大量細(xì)胞呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有2～3層正常細(xì)胞，排列較緊密，有少量細(xì)胞出現(xiàn)深染現(xiàn)象，正常細(xì)胞周圍出現(xiàn)淺粉色結(jié)構(gòu)（見圖2）。8周時，正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)與4周時比較變化不明顯；卒中組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)不完整，有1～2層細(xì)胞，染色深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞量少，多呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有1～2層正常細(xì)胞，排列較緊密，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核仁清晰，深染細(xì)胞較少（見圖3）。

正常組假手術(shù)組 卒中組PSD組 西藥組中藥組

正常組假手術(shù)組 卒中組PSD組 西藥組中藥組

正常組假手術(shù)組 卒中組PSD組 西藥組中藥組

5 討論

本實驗在腦缺血模型基礎(chǔ)上應(yīng)用慢性束縛應(yīng)激復(fù)合單籠飼養(yǎng)方法制備PSD大鼠模型，觀察頤腦解郁復(fù)方對PSD大鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū)的干預(yù)作用。實驗中采用線栓法制備腦卒中模型，在充分考慮大鼠腦卒中病理基礎(chǔ)上，選用刺激溫和、量小的慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)的方法制備PSD大鼠模型。該模型既有腦缺血卒中和抑郁發(fā)病的病理基礎(chǔ)，又有卒中后肢體活動受限、離開親友等情志刺激因素，模擬了PSD發(fā)生的生物學(xué)和心理學(xué)因素[7]，操作較簡單，造模成功率高，是理想的PSD大鼠模型。行為學(xué)測試結(jié)果顯示，4周時可成功建立PSD大鼠模型。

海馬與人類的學(xué)習(xí)及情感等認(rèn)知功能密切相關(guān)，是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的最重要的腦區(qū)之一。研究表明，PSD大鼠存在腦卒中損傷側(cè)海馬神經(jīng)再生障礙，而海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡會引發(fā)一系列抑郁癥狀[8]。本實驗觀察了大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)病理變化，發(fā)現(xiàn)PSD組大鼠海馬CA1區(qū)較卒中組受損嚴(yán)重，應(yīng)用藥物干預(yù)的西藥組與中藥組大鼠海馬CA1區(qū)受損情況明顯減輕，提示PSD加重卒中后海馬CA1區(qū)受損情況，而中藥頤腦解郁復(fù)方可改善海馬CA1區(qū)受損情況，保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞。

中醫(yī)“腦髓”的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)是腦內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)營養(yǎng)因子。腎主生髓，“補(bǔ)腎填髓”中藥可減少神經(jīng)元死亡，促進(jìn)神經(jīng)元存活與再生[9]。肝主疏泄，主藏血，具有調(diào)暢氣機(jī)、調(diào)節(jié)血量的職能，腦的血供和營養(yǎng)依賴于肝所藏之血及肝的疏泄功能[10]。研究表明，舒肝活血中藥復(fù)方能改善中風(fēng)后抑郁狀態(tài)[11]，并可保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)元，緩解細(xì)胞凋亡[12]。本課題組認(rèn)為腦卒中多因腎虛髓海失充，元神失養(yǎng)致病，而后情志不遂，肝氣失調(diào)，痰瘀互結(jié)，發(fā)生PSD。病位在肝腎二臟，腎虛為基礎(chǔ)，又兼氣、痰、瘀阻滯。故課題組選用補(bǔ)腎填精、疏肝活血中藥，立頤腦解郁復(fù)方以益腎舒肝、活血化瘀、頤腦醒神。行為學(xué)及病理結(jié)果顯示，頤腦解郁復(fù)方可改善大鼠PSD癥狀，減輕大鼠海馬CA1區(qū)受損情況，保護(hù)海馬CA1區(qū)細(xì)胞。

有研究表明，益腎舒肝中藥復(fù)方可顯著增強(qiáng)PSD大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維生長因子等表達(dá)[13]，參與調(diào)節(jié)PSD的多條信號通路[14-15]，但其防治機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，目前研究尚未完全闡明。本實驗從行為學(xué)和病理改變探討頤腦解郁復(fù)方對PSD的干預(yù)作用，研究尚不深入，未來將在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化及信號分子的變化方面加以探索。

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Effects ofPrescription on the Behaviors and Damages of Pathology in Hippocampal CA1 Area of Rats with Post-stroke Depression

TIAN Hui-ling1, LI Xiao-li1, TANG Qi-sheng1, LI Xia1, LI Qing-meng1, GAO Yu-shan2, ZHANG Wen1, SUN Xin-yue1, Shao Jun1

Objective To investigate the intervention effects ofPrescription on the behaviors and damages in hippocampal CA1 area of the rats with post-stroke depression (PSD). Methods Totally 168 SPF male SD rats were randomly divided into normal group, sham-operation group, stroke group, PSD group, Western medicine group and TCM group. There were 24 rats in the normal group and sham-operation group, and 30 rats in the other groups. Rats in the normal group received no intervention. Rats in the sham-operation group received no suture. Rats in the stroke group were given middle cerebral artery occlusion operation and normally fed after operation. Rats in the PSD group, Western medicinal group and TCM group were made into PSD models by chronic immobilization stress for one week and individual battery to the end. At the inception of modeling, Western medicine group received fluoxetine hydrochloride for gavage; TCM group receivedPrescription for gavage; other groups received distilled water for gavage, once a day. At the end of week 2, 4, and 8, the morphology of the hippocampal CA1 area in each rat was observed by microscope after HE stained. Results Except for the week 2, at the same time point, the behavior scores of the rats in the TCM group were higher than those in the PSD group. At the same time point, the CA1 region of the hippocampus in the TCM group was more complete than the PSD group, and the cells were arranged neatly and in normal morphology. ConclusionPrescription can improve the symptoms of PSD rats, and has protective effects on hippocampal CA1 area.

Prescription; post-stroke depression; behaviors; hippocampal CA1 area; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.012

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0049-05

國家自然科學(xué)基金（81673930）；北京市自然科學(xué)基金（7142100）

李小黎，E-mail：tigerlxl2002@163.com

（2016-10-30）

（2016-11-30；編輯：華強(qiáng)）