孟赫禹,崔 蘭

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2013年級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，吉林 延吉133000；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科)

*通訊作者

外周血CHD9基因低表達(dá)預(yù)示急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)增加

孟赫禹1,崔 蘭2*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2013年級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，吉林 延吉133000；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CAD)是由環(huán)境因素與遺傳因素共同作用而導(dǎo)致的最常見(jiàn)心血管疾病。已知的危險(xiǎn)因素，如高血壓、血脂異常、血糖升高、吸煙等長(zhǎng)期積累，結(jié)合遺傳背景最終將導(dǎo)致急性心血管事件(如，急性心肌梗死，AMI)的發(fā)生，常常危及患者生命。因此，臨床上需要有效的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方法，對(duì)高危人群給予有效識(shí)別，從而更早的干預(yù)，來(lái)降低急性心血管事件的發(fā)生，改善病人預(yù)后。

基因組中編碼的遺傳信息是穩(wěn)定的，大多數(shù)情況下是不可變的。然而研究表明，大約有25000個(gè)基因在RNA水平的表達(dá)是高度可變的，可以反應(yīng)機(jī)體短期內(nèi)的生理和病例變化。外周全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)的改變已被證實(shí)對(duì)CAD有顯著的預(yù)測(cè)價(jià)值[1]。基因表達(dá)分析可以為疾病近期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)提供新的生物標(biāo)志物[2]。

本課題組前期進(jìn)行的外周血急性心肌梗死差異基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示：在急性心肌梗死病人的外周血白細(xì)胞中存在著大量差異表達(dá)的基因[3]。其中，CHD9基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達(dá)。本研究將在前期研究成果的基礎(chǔ)之上，通過(guò)擴(kuò)大樣本量，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證CHD9基因在急性心肌梗死發(fā)病過(guò)程中的差異表達(dá)，并分析CHD9基因促進(jìn)急性心肌梗死發(fā)病的可能機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

依據(jù)2012年公布的心肌梗死全球統(tǒng)一定義[4]。選取2014年11月-2016年3月于我院心血管內(nèi)科住院治療，明確診斷為急性心肌梗死的病人113例為急性心肌梗死組。非冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病者114例為對(duì)照組。并根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照Gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)研究對(duì)象的冠狀動(dòng)脈血管病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，分值越高病變?cè)絿?yán)重[5]。

本研究排除標(biāo)準(zhǔn)：①因經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)引發(fā)的心肌梗死。②繼發(fā)于供需失衡相關(guān)的心肌損傷：如冠脈內(nèi)皮功能障礙無(wú)明顯冠脈疾病、冠脈痙攣、冠脈栓塞、快速/緩慢型心律失常、嚴(yán)重貧血、重癥呼吸衰竭、主動(dòng)脈夾層或嚴(yán)重主動(dòng)脈瓣疾病、肥厚型心肌病等。③非心肌缺血相關(guān)的心肌損傷：心臟挫傷、手術(shù)、消融、起搏、或除顫儀除顫、伴心臟受累的橫紋肌溶解癥、心肌炎、心臟毒性藥物等。④多因素或不確定的心肌損傷：嚴(yán)重心力衰竭、應(yīng)激性心肌病、嚴(yán)重肺栓塞或肺動(dòng)脈高壓、敗血癥和危重病人、腎功能衰竭、嚴(yán)重的急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血等。⑤合并有嚴(yán)重感染性疾病、惡性腫瘤。⑥正在患有的、慢性的或復(fù)發(fā)性的傳染性疾病史。⑦(活動(dòng)性或潛伏性)結(jié)核感染史或證據(jù)。⑧患有免疫系統(tǒng)疾病和(或)正在服用激素。懷疑或證實(shí)處于免疫缺陷狀態(tài)的患者。⑨臨床資料或者冠脈造影資料不全者。

詳細(xì)記錄臨床資料，包括：用藥史、血脂水平、空腹血糖水平、靜息血壓、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、冠狀動(dòng)脈造影資料、冠心病家族史、吸煙史，以及合并其它臨床疾病情況(如高血壓、糖尿病)等。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集、總RNA提取及cDNA合成

留取各研究對(duì)象晨起空腹外周靜脈血4 ml，利用血液總RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit,天根生化科技有限公司，北京)，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)已獲取的外周血進(jìn)行總RNA提取，并利用1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)對(duì)RNA的質(zhì)量及濃度進(jìn)行檢測(cè)。合格的RNA樣本A260/A280值在1.9和2.1之間，且A260/A230值大于2。瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)明亮的28S和18S rRNA條帶，且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA的兩倍。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO Rever Tra Ace qPRC RT kit，上海)，取總量為1 μg合格的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA樣品保存于-20℃以便下一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 利用SYBR熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM ，TaKaRa,大連)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用20 μl反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)包括:10 μl SYBR Premix Ex Taq TM，上、下游引物各0.5 μl(濃度為10 μmol/L)，無(wú)核酸酶的雙蒸水8 μl，cDNA模板1 μl。應(yīng)用Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Strata Gene)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃10 min；40個(gè)循環(huán)：95℃ 15 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s；95℃ 1 min，55℃ 30s,95℃ 30 s。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，所有樣本至少重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果取均值。每個(gè)樣本所得循環(huán)閾值(Ct)以相對(duì)表達(dá)量2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)，并進(jìn)行比較。急性心肌梗死組對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[6]，△△Ct=急性心肌跟死組△Ct-對(duì)照組△Ct。所用PCR引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的CHD9基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為153 bp。收集實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析

研究對(duì)象的臨床資料分析結(jié)果表明：在年齡、性別、BMI、高血壓病史、冠心病家族史、收縮壓、舒張壓及高密度脂蛋白膽固醇水平(HDL-C)等方面，兩組未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而與對(duì)照組相比，急性心肌梗死組吸煙史比例更高；合并糖尿病情況及空腹血糖水平明顯高于對(duì)照組；血總膽固醇水平(TC)、甘油三酯水平(TG)和低密度脂蛋白膽固醇水平(LDL-C)明顯高于對(duì)照組。差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

外周血RNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：CHD9基因擴(kuò)增曲線為顯著平滑的“S型”。溶解曲線呈現(xiàn)單一的溶解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1。電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)單一明亮條帶，片段大小約153 bp，與預(yù)期片段大小一致。PCR擴(kuò)增反應(yīng)成功，產(chǎn)物特異性較好。

表1 急性心肌梗死組與對(duì)照組臨床資料比較

1：DL500 DNA ladder marker；2、3：RT-PCR products.圖1 CHD9基因RT-PCR擴(kuò)增目的片段電泳圖

2.3 CHD9基因mRNA在急性心肌梗死組和對(duì)照組的表達(dá)量

RT-PCR所得每個(gè)樣本的ΔCt值均為單個(gè)樣本重復(fù)3次測(cè)量所得均值。CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)采用2-ΔΔCt方法。結(jié)果顯示，急性心肌梗死組2-△Ct為0.03(0.02-0.05)，對(duì)照組2-△Ct為0.06(0.04-0.13)，兩組差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-7.09，P=0.00)。在RNA水平急性心肌梗死組外周血中CHD9基因表達(dá)明顯低于對(duì)照組，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.35±0.29倍，見(jiàn)圖2。

圖2 CHD9基因mRNA相對(duì)表達(dá)量 **P<0.01

2.4 采用Logistic回歸分析CHD9基因相對(duì)表達(dá)量及其他因素與急性心肌梗死的關(guān)系

按CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)將所有研究對(duì)象分為高表達(dá)組(2-△Ct>0.044)和低表達(dá)組(2-△Ct≤0.044)，進(jìn)一步采用逐步二元Logistic回歸分析CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量、年齡、性別、BMI、冠心病家族史、吸煙史、高血壓、糖尿病、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇等因素與急性心肌梗死的相關(guān)性。結(jié)果顯示：CHD9基因的低表達(dá)和吸煙、空腹血糖增高、血低密度脂蛋白膽固醇水平升高均是急性心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CHD9基因低表達(dá)使急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)增高4倍，見(jiàn)表2。

表2 急性心肌梗死獨(dú)立危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 CHD9基因相對(duì)表達(dá)量與空腹血糖及血脂等指標(biāo)的關(guān)系

將所有納入的研究對(duì)象分別按空腹血糖水平和血脂水平分為：血糖正常組和血糖升高組、TC正常組和TC升高組、TG正常組和TG升高組、LDL-C正常組和LDL-C升高組。分別比較組間CHD9基因的表達(dá)量。每個(gè)研究對(duì)象CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量以2-△Ct表示。結(jié)果顯示：CHD9基因表達(dá)量在血糖正常組與血糖升高組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.62，P=0.01)；CHD9基因表達(dá)量在TC正常組與TC升高組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CHD9基因表達(dá)量在TG正常組與TG升高組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CHD9基因表達(dá)量在LDL-C正常組與LDL-C升高組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意，見(jiàn)表3。

表3 不同組別間CHD9基因相對(duì)表達(dá)量比較

a : 血糖正常組和血糖升高組比；b: TC正常組和TC升高組比；c：TG正常組和TG升高組比；d：LDL-C正常組和LDL-C升高組比

2.6 CHD9基因相對(duì)表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性

根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照Gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)急性心肌梗死組冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。分值越高代表冠狀動(dòng)脈狹窄越重。急性心肌梗死組Gensini評(píng)分結(jié)果為60.00(36.00-88.00)，對(duì)CHD9基因和Gensini分值進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，結(jié)果顯示：CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量與Gensini分值呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.54，P=0.00)，即CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量越低，Gensini分值越高，冠狀動(dòng)脈狹窄則越重。

2.7 CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白I(TnI)的相關(guān)性

急性心肌梗死組心肌肌鈣蛋白檢測(cè)結(jié)果為0.47(0.11-9.60)ng/ml。血清肌鈣蛋白I(TnI)濃度的高低反應(yīng)了急性心肌梗死的范圍的大小。血清TnI和CHD9基因相對(duì)表達(dá)量的雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示：rs=-0.09(P=0.43)。外周血中CHD9基因表達(dá)量的高低與血清TnI濃度無(wú)關(guān)。這表明CHD9的低表達(dá)與心肌梗死的范圍無(wú)關(guān)。

2.8 CHD9基因相對(duì)表達(dá)量在急性心肌梗死中的ROC曲線和cut off值

根據(jù)急性心肌梗死組和對(duì)照組各樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得CHD9相對(duì)表達(dá)量2-△CT值繪制ROC曲線，見(jiàn)圖3。從圖3可知CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量對(duì)急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價(jià)值，曲線下面積(AUC)為0.77±0.03(P=0.00)，以約登指數(shù)最大值確定的CHD9基因相對(duì)表達(dá)量cut off值為0.032，敏感度為55.8%，特異性為87.7%。

圖3 CHD9基因相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線

3 討論

染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白(CHD)家族為屬于SNF2超家族ATP依賴的染色質(zhì)重塑酶。遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究表明CHD家族是重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與著染色質(zhì)的重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)等細(xì)胞過(guò)程[7,8]。多種CHD家族成員已被發(fā)現(xiàn)其基因的突變或表達(dá)異常與人類的某些疾病相關(guān)，特別是在腫瘤研究領(lǐng)域[9-12]。但在心血管領(lǐng)域?qū)τ贑HD家族的研究較少。CHD9是由Shur I等首次發(fā)現(xiàn)的[13]，其屬于CHD家族的第三個(gè)亞族。因其發(fā)現(xiàn)較晚，對(duì)于CHD9基因與疾病的關(guān)系目前研究較少。本課題組前期的急性心肌梗死外周血差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CHD9基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達(dá)[3]。本研究在前期工作基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證了外周血中CHD9基因在急性心肌梗死發(fā)病過(guò)程中表達(dá)量顯著降低。

本研究的臨床資料進(jìn)行分析表明：急性心肌梗死組，吸煙者比例更高；合并糖尿病情況及空腹血糖水平明顯高于對(duì)照組；血總膽固醇水平(TC)、甘油三酯水平(TG)和低密度脂蛋白膽固醇水平(LDL-C)也明顯高于對(duì)照組，這與我們的臨床實(shí)踐相一致。Logistic回歸分析亦顯示：CHD9基因的低表達(dá)與吸煙、空腹血糖增高以及血低密度脂蛋白膽固醇水平升高一樣均是急性心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CHD9基因低表達(dá)組急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)為高表達(dá)組的5倍。

本研究中，按正常及異常的TC、TG、LDL-C和空腹血糖水平將所有研究對(duì)象分組比較組間CHD9基因表達(dá)的差異，結(jié)果顯示：空腹血糖升高組CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量明顯低于空腹血糖正常組。血糖的升高與CHD9基因的低表達(dá)相關(guān)，因此在急性心肌梗死發(fā)病過(guò)程中CHD9基因可能是通過(guò)影響糖代謝而影響到急性心肌梗死的發(fā)生。但在TC正常組與TC升高組之間、TG正常組與TG升高組之間、LDL-C正常組與LDL-C升高組之間，CHD9基因的表達(dá)量無(wú)明顯差異。

Gensini評(píng)分反應(yīng)了冠狀動(dòng)脈病變狹窄的嚴(yán)重程度，Gensini分值越高代表冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度越重，病變狹窄越嚴(yán)重。CHD9基因相對(duì)表達(dá)量與Gensini評(píng)分的相關(guān)性分析表明：CHD9基因表達(dá)量與Gensini評(píng)分結(jié)果呈顯著負(fù)相關(guān)，即CHD9基因的表達(dá)量越低，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度越重。

然而，本研究中，并未觀察到CHD9基因的mRNA表達(dá)量與血清TnI的水平具有相關(guān)性。心肌肌鈣蛋白是目前公認(rèn)的能夠高特異性、高敏感性的反映心肌細(xì)胞損傷壞死的標(biāo)記物。血液中肌鈣蛋白濃度越高表明心肌因缺血缺氧導(dǎo)致的心肌壞死范圍越大[14]。CHD9基因的mRNA表達(dá)量與心肌梗死的程度沒(méi)有相關(guān)性。

綜合以上研究結(jié)果，我們可以合理地推測(cè)：CHD9基因低表達(dá)通過(guò)影響糖代謝，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，從而促進(jìn)了急性心肌梗死的發(fā)生。

本研究不足：通路分析顯示，CHD9基因廣泛參與著膽固醇的合成調(diào)節(jié)，甘油三酯、脂肪酸和酮體的代謝(from REACTOME)。但在我們的研究中CHD9基因的表達(dá)量在不同血脂水平間未顯示出差異。而外周血中CHD9基因的表達(dá)量與血糖水平卻有相關(guān)性。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步對(duì)CHD9基因的生物學(xué)功能進(jìn)行驗(yàn)證。

ROC曲線結(jié)果表明CHD9基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)于急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價(jià)值。CHD9基因的相對(duì)表達(dá)量用于急性心肌梗死診斷的特異性較高但是敏感度不高。以該基因的低表達(dá)單一因素作為急性心肌梗死診斷的指標(biāo)尚不夠敏感，但其可以作為急性心肌梗死鑒別診斷的重要參考指標(biāo)。急性心肌梗死是由多因素聯(lián)合作用導(dǎo)致的多基因遺傳病，參與該病形成的基因眾多且相互影響較為復(fù)雜，隨著更多風(fēng)險(xiǎn)基因的發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因的檢測(cè)結(jié)果將提高對(duì)心肌梗死診斷的敏感度。

CHD9基因在急性心肌梗死病人外周血中表達(dá)顯著降低；CHD9基因表達(dá)量降低是急性心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；CHD9基因低表達(dá)使急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)增加4倍。外周血中CHD9基因的低表達(dá)反映了冠狀動(dòng)脈病變的嚴(yán)重程度；CHD9基因可能是通過(guò)影響血糖代謝，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，最終導(dǎo)致AMI的發(fā)生。

致謝：感謝吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院趙志輝教授及其團(tuán)隊(duì)對(duì)本研究提供的技術(shù)指導(dǎo)。

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