張明明,李 婷,鄭春雨,董 雪*

(1.吉林省人民醫(yī)院,吉林 長春130021; 2.長春中醫(yī)藥大學(xué))

地砷病區(qū)乳腺癌致病機(jī)制研究

張明明1,李 婷2,鄭春雨2,董 雪2*

(1.吉林省人民醫(yī)院,吉林 長春130021; 2.長春中醫(yī)藥大學(xué))

目的 研究亞砷酸鈉(NaAsO2)對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞(NMuMG)增殖的抑制作用機(jī)制，為地砷病區(qū)乳腺癌致病機(jī)制提供理論依據(jù)。方法 以不同濃度的NaAsO2(0,5,10，20,30 μM)處理的NMuMG，觀察其形態(tài)的變化；經(jīng)Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 測(cè)定不同濃度NaAsO2對(duì)NMuMG增殖情況；用實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析增殖基因c-myc mRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果 在一定濃度范圍內(nèi)，隨亞砷酸鈉濃度升高，其細(xì)胞間隙變寬、形狀不規(guī)則，甚至凋亡。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著NaAsO2濃度增高其增殖明顯受到抑制，呈明確的劑量-效應(yīng)關(guān)系； 20 μM NaAsO2使c-myc mRNA表達(dá)水平明顯降到11%。結(jié)論 亞砷酸鈉抑制NMuMG的增殖是通過降低增殖基因c-myc的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，這是地砷病區(qū)乳腺癌疾病高發(fā)的原因之一。

亞砷酸鈉;增殖;c-myc

(ChinJLabDiagn,2017,21:1064)

乳腺癌是占女性死亡第二位的惡性腫瘤，且其發(fā)病率在近30年正逐漸上升[1,2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，地砷病區(qū)其乳腺癌的發(fā)病率高于其他地區(qū)，吉林省就是飲水中砷含量超標(biāo)的地砷病區(qū)[3]。在美國環(huán)境保護(hù)協(xié)會(huì)和國際癌癥研究中心發(fā)布的Ⅰ類致癌藥物砷已位列其中[4]。由于砷致癌機(jī)制十分復(fù)雜，目前不是十分清楚，本研究檢測(cè)了一定劑量范圍內(nèi)亞砷酸鈉對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)及增殖影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 亞砷酸鈉(NaAsO2)、胰島素，購于SIGMA公司；小鼠乳腺上皮細(xì)胞(NMuMG)由瑞典大學(xué)ARIS教授友情饋贈(zèng)，Gibco公司提供(Dulbecco's Modified Eagle Media ，DMEM)培養(yǎng)基；北京元亨金馬生物公司提供優(yōu)級(jí)胎牛血清；碧云天公司提供CCK-8試劑盒購自于；Takara 公司提供Trizol試劑盒、RT-PCR 試劑盒；ABI 公司提供 2 *SYBR Green Ⅰ試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) NMuMG培養(yǎng)條件是在含10 %胎牛血清+10 μg/ml胰島素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 將指數(shù)增長期的NMuMG制成單細(xì)胞懸液，接種于24孔板每孔密度3*103/ml，每孔1.5 ml培養(yǎng)基，待細(xì)胞長至70%-80%融合后，(0,5,10，20,30) μM NaAsO2溶液替換原有培養(yǎng)基，作用24 h后，利用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并照相。

1.4 細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 將指數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板， 5*103個(gè)細(xì)胞/ 孔，100 μl/ 孔，每孔均是不同濃度亞砷酸鈉溶液(每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔)，作用24小時(shí)后，將10 μl CCK-8加入每孔中，并將孔板重新置于培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育1 小時(shí)，室溫下振蕩5 分鐘，酶標(biāo)儀檢測(cè)其在450 nm吸光度值，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算存活率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)= [ (1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值) /對(duì)照組平均OD值]*100%；

1.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) 提取細(xì)胞總RNA，并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(具體操作步驟均按廠家產(chǎn)品說明書進(jìn)行)，其反應(yīng)條件為：30℃、10 min，42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min。c-Myc采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(SYBR Green 法) 進(jìn)行，反應(yīng)體積為25 μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；92 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共50個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

利用共聚焦顯微鏡觀察亞砷酸鈉對(duì)NMuMG形態(tài)的影響，DIC照相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0 μM對(duì)照組細(xì)胞呈上皮細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞間連接緊密且貼壁生長，狀態(tài)良好；經(jīng)不同濃度亞砷酸鈉作用24 h后，隨著其濃度升高，細(xì)胞間隙逐漸變大，細(xì)胞形狀不規(guī)則，有部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，漂浮的死細(xì)胞越來越多(圖1)。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物

注：亞砷酸鈉濃度A:0 μM B:5 μM C:10 μM D:20 μM E:30 μM圖1 亞砷酸鈉改變NMuMG的形態(tài)(200*)

2.2 NaAsO2抑制NMuMG增殖

用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。以不同濃度的亞砷酸鈉處理NMuMG，作用24 h后，發(fā)現(xiàn)隨著亞砷酸鈉濃度的增高，細(xì)胞增殖均呈不同程度的抑制(圖2)，當(dāng)濃度達(dá)到10μM時(shí)，即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且有劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 NaAsO2降低增殖基因c-Myc mRNA表達(dá)水平

c-Myc是細(xì)胞增殖相關(guān)基因，其表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖即受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。將20 μM的NaAsO2作用小鼠乳腺上皮細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，并提取RNA，同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)過內(nèi)參及未處理組校正過，每次2個(gè)副孔且實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NMuMG經(jīng)20 μM NaAsO2作用后，其c-Myc的mRNA表達(dá)水平明顯降低到11%，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01)，如圖3所示，這表明NaAsO2通過降低c-Myc的mRNA表達(dá)水平來抑制NMuMG增殖。

*P<0.05 **P<0.01圖2 亞砷酸鈉抑制NMuMG增殖

**P<0.01圖3 NaAsO2 抑制NMuMG C- MYC mRNA的表達(dá)

3 討論

中國一直是飽受砷污染的國家，其中吉林、新疆、云南、山西等省份尤為嚴(yán)重，比較常見的是飲水中砷含量超標(biāo)。這些地區(qū)的女性乳腺癌發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，為了解砷致乳腺癌的致癌機(jī)理，本研究以NMuMG為研究對(duì)象，觀察砷對(duì)其毒性作用。

本研究中，NMuMG發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度的NaAsO2作用后，其形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞間隔變大，形態(tài)各異，且隨著NaAsO2濃度上升，導(dǎo)致凋亡的細(xì)胞逐漸增多。CCK-8檢測(cè)結(jié)果充分說明了NaAsO2明顯抑制了NMuMG的增殖且呈典型的劑量-效應(yīng)關(guān)系。Liy等人將5 μM As2O3牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，僅4 h即導(dǎo)致細(xì)胞 DNA 鏈的斷裂[5]，Barchowsky等人將5 μM As2O3作用血管內(nèi)皮細(xì)胞僅4 h，其細(xì)胞DNA合成就受到抑制[6]。

c-Myc是與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因，細(xì)胞增殖過程中其表達(dá)水平升高。在本研究中NMuMG經(jīng)20μM NaAsO2作用24小時(shí)后，c-Myc的mRNA表達(dá)顯著降低，說明NaAsO2對(duì)NMuMG的增殖抑制作用是通過抑制c-Myc表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

許多研究結(jié)果表明，砷化物通過抑制細(xì)胞的增殖，從而引起凋亡來發(fā)揮其毒性作用的。如Shah P等人發(fā)現(xiàn)小鼠通過飲水長期攝入低劑量砷后，皮膚細(xì)胞的增殖受到抑制進(jìn)而凋亡從而導(dǎo)致皮膚癌[7]。在我們的前期研究中就發(fā)現(xiàn)低濃度的亞砷酸鈉即可抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[8]。Hu,Y等人研究發(fā)現(xiàn)低劑量的亞砷酸鹽、長時(shí)間作用于正常人體細(xì)胞，常見的慢性砷中毒(地砷病)會(huì)通過下調(diào)NF-kB的DNA結(jié)合，而NF-kB是抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子，凋亡細(xì)胞減少，引起腫瘤的發(fā)生[9]。本研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的砷作用于小鼠乳腺上皮細(xì)胞導(dǎo)致其增殖受到抑制，這可能是其致乳腺癌機(jī)制之一。

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Study on Pathogenic Mechanism of Breast Cancer in Arsenic Ward

ZHANGMing-ming,LiTing,ZHENGChun-yu,etal.

(People'sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Objective The studies were carried out to explore the effect of sodium arsenite on the proliferation of mouse mammary epithelial cells (NMuMG) and its molecular mechanisms.Methods The changes of NMuMG were observed by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) at different concentrations of NaAsO2(0,5,10,20,30 μM).The proliferation of NMuMG was determined by real-time quantitative RT The expression of proliferating gene c-myc mRNAs was analyzed by PCR.Results In a certain concentration range,with the concentration of sodium arsenate increased,the cell gap widened,irregular shape,and even apoptosis.In a certain concentration range,the proliferation was significantly inhibited with the increase of NaAsO2concentration,showing a clear dose-effect relationship;20 μM NaAsO2significantly reduced the expression of c-myc mRNA to 11%.Conclusion and Discussion:Sodium arsenite may further inhibit the proliferation of NMuMG by downregulating the expression of c-myc gene,which may be one of the mechanisms of endemic arsenic poisoning leading to breast cancer.

Arsenic;Proliferation;c-myc

吉林省教育廳項(xiàng)目(20163)

*通訊作者

1007-4287(2017)06-1064-03

R737.9

A

張明明，男，副教授，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科及老年病學(xué);董雪，女，博士，副教授，研究方向地方病學(xué)及老年病方面的研究。

2016-12-17)